Resumen
Las células de la granulosa (GC) y las células de la teca (TC) tienen comunicaciones e interacciones complejas. El metabolismo de los lípidos en los GC es importante para el desarrollo del folículo, que también es inseparable del papel de los TC; sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros. En este estudio, seleccionamos el folículo preovulatorio (F1) de los gansos, una especie de ave con una producción de huevos relativamente baja, que exhibe un alto contenido de lípidos y un metabolismo lipídico vigoroso. Utilizando enfoques transcriptómicos y metabolómicos, analizamos los efectos de los TC en los GC en un modelo de cocultivo. Identificamos y seleccionamos las funciones principales y las vías de señalización asociadas con los metabolitos expresados diferencialmente (DEM) y genes (DEG) entre los grupos de monocultivo y cocultivo. Posteriormente, los metabolitos y genes clave dentro de la vía central se validaron mediante ELISA y qPCR. Tanto los resultados transcriptómicos como los metabolómicos mostraron que después del cocultivo, los perfiles de expresión genética y de metabolitos de los GC se alteraron significativamente. El análisis de enriquecimiento reveló que tanto los DEM como los DEG estaban significativamente asociados con las vías del metabolismo de los esfingolípidos y los glicerofosfolípidos. En el grupo de cocultivo, los resultados metabolómicos y ELISA indicaron que las concentraciones de los metabolitos principales, fosforilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE), en los GC aumentaron significativamente (pag < 0,05). Los resultados transcriptómicos y de qPCR mostraron que los niveles de expresión de genes implicados en el catabolismo de la PC, incluidos los genes de fosfolipasa A2 épsilon-like-1, fosfolipasa A2 épsilon-like-2 y fosfolipasa A2 en GC, disminuyeron significativamente (pag< 0,05). En resumen, nuestros resultados sugieren que los TC pueden afectar el metabolismo lipídico de los GC en los folículos F1 de ganso al promover la síntesis de PC dentro de la vía del metabolismo de los glicerofosfolípidos.
Introducción
La célula de la granulosa (GC), como componente del folículo, juega un papel importante en el reclutamiento, crecimiento, selección y maduración de los folículos al proporcionar apoyo, nutrición y factores secretores.1,2). En mamíferos, numerosos estudios han demostrado que la proliferación, apoptosis y síntesis de esteroides de GC desempeñan un papel importante en el desarrollo folicular.3–5). Recientemente, un número creciente de estudios han demostrado que el metabolismo de los lípidos en los GC también tiene implicaciones importantes para el desarrollo folicular.3–6). En bovinos, ovinos y humanos, el metabolismo lipídico de los GC también juega un papel importante en el desarrollo folicular y la maduración de los ovocitos.7–11), particularmente en el transporte de nutrientes y el intercambio de señales. (12). A diferencia de los mamíferos, los folículos de las aves contienen yema, que es rica en lípidos. Por lo tanto, es probable que el metabolismo de los lípidos en los GC sea aún más crítico e intrigante durante el desarrollo folicular en las aves. Sin embargo, rara vez se ha informado del metabolismo de los lípidos en los folículos de las aves. Nuestra investigación publicada demuestra que la lipogénesis de novo (DNL) existe en los GC de aves de corral y puede desempeñar un papel importante en su metabolismo lipídico (13). Es evidente que el metabolismo de los lípidos en los GC es más complejo durante el desarrollo de los folículos de las aves que en los mamíferos.
La célula de la teca (CT) también es un componente de los folículos. Los TC y GC se encuentran en lados opuestos de la lámina basal folicular y, por lo tanto, se comunican a través de ella principalmente a través de mecanismos endocrinos.14–16). La influencia de los TC sobre los GC persiste durante todo el desarrollo folicular. A través de la señalización paracrina, los TC mantienen una comunicación dinámica con los GC, apoyando el desarrollo normal tanto de los GC como del folículo.17–19). De manera similar, el metabolismo de los lípidos en los GC también está regulado por los TC. Sin embargo, en las especies de aves, los TC tienen un patrón regulador único para los GC, que es significativamente diferente al de los mamíferos. Esta singularidad limita aún más nuestra exploración de los patrones del metabolismo de los lípidos en los GC de aves. En un estudio anterior, simulamos condiciones in vivo estableciendo un modelo de cocultivo in vitro de GC y TC. Descubrimos que los TC tenían un impacto significativo en las propiedades fisiológicas de los GC en todas las etapas del desarrollo folicular, incluido su proceso DNL (20). Además, en los folículos preovulatorios (F1), los TC pueden actuar sobre los GC y provocar una regulación negativa significativa de FASy CACque son genes clave en la ruta de síntesis de DNL en GC (20). Obviamente, los TC desempeñan un papel importante en el metabolismo de los lípidos en los GC. Sin embargo, los estudios anteriores se han limitado al proceso DNL. El impacto más amplio de los TC en las vías del metabolismo de los lípidos en los GC y los mecanismos reguladores subyacentes aún no están claros.
En este estudio, nos centramos en los folículos F1, que exhiben el mayor contenido de lípidos, deposición y actividad metabólica. Empleando nuestro modelo de cocultivo GC-TC establecido, combinamos análisis transcriptómicos y metabolómicos para identificar las moléculas y vías relacionadas con los lípidos en los GC que están influenciadas por los TC. Este enfoque nos permitió dilucidar el patrón mediante el cual los TC regulan el metabolismo de los lípidos en los GC dentro de los folículos F1 de ganso. Se espera que los hallazgos de este trabajo proporcionen una base teórica para comprender los mecanismos del desarrollo folicular en las aves de corral.
Materiales y métodos
Animales de experimentación
Este estudio utilizó gansos de carne Tianfu (Anser cygnoides) ponedores sanos de una línea materna, de 35 a 45 semanas de edad. Los gansos fueron alojados en condiciones de luz y temperatura naturales en la Granja Experimental para la Cría de Aves Acuáticas de la Universidad Agrícola de Sichuan (Sichuan, China) y tuvieron libre acceso a alimento y agua. Se registró el ciclo de puesta de cada ganso. Los gansos en el mismo ciclo de puesta fueron sacrificados mediante dislocación cervical 7 a 9 h antes del tiempo esperado de oviposición. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de los Animales de Laboratorio de la Universidad Agrícola de Sichuan (Permiso No. 20220154).
Separación de GC y TC del folículo de ganso en la etapa F1
Folículo F1 (21) se diseccionaron de los ovarios y se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato estéril helada (PBS, pH 7,4, Solarbio). El tejido conectivo se despegó cuidadosamente con unas pinzas y se hizo una hendidura (de aproximadamente 0,5 a 2,0 cm de largo) en el lado opuesto al tallo utilizando un bisturí quirúrgico, permitiendo que la yema y la capa de granulosa fluyeran hacia afuera. Luego se separaron los tejidos de la granulosa y la teca y se lavaron repetidamente con PBS para eliminar la yema residual. El posterior aislamiento y cultivo de GC y TC se llevaron a cabo siguiendo nuestros protocolos establecidos (21,22).
Monocultivo y cocultivo de GC de ganso.
Se sembraron células de la granulosa (GC) de folículos F1 en placas de seis pocillos (Corning) a una densidad de 1,2 x 10⁶ células por pocillo en 2,5 ml de medio DMEM/F-12 (HyClone). Se sembraron células de teca (TC) de la misma etapa folicular en insertos Transwell (tamaño de poro: 0,4 μm; Corning) colocados en las mismas placas de seis pocillos a 1 x 10⁶ células por inserto en 1,5 ml de medio. Todas las células se cultivaron a 37°C bajo CO₂ al 5% en una atmósfera humidificada. El medio se reemplazó después de 6 a 8 horas, una vez confirmada la adhesión celular. Para el grupo de cocultivo, los GC y TC del mismo folículo se cultivaron juntos en el mismo sistema de placas, designándose el inicio del cocultivo como 0 horas. En el grupo de control de monocultivo, los GC se cultivaron con un inserto Transwell libre de células que contenía 1,5 ml de medio (23).
Análisis del transcriptoma
Se extrajo el ARN total de las células. La concentración y la integridad del ARN se evaluaron utilizando un sistema Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, CA, EE. UU.). Luego, se utilizaron de 1 a 4 μg de ARN por muestra como material de entrada para la construcción de la biblioteca de transcriptomas. Tras el control de calidad, las bibliotecas cualificadas se agruparon en función de su concentración efectiva y la profundidad de secuenciación deseada. Luego se secuenció el conjunto en una plataforma Illumina para generar lecturas de extremos emparejados de 150 pb. Se obtuvieron lecturas limpias filtrando las lecturas que contienen adaptadores, las lecturas poli-N y las lecturas de baja calidad de los datos sin procesar. El índice del genoma de referencia se construyó utilizando HISAT2 (v2.0.5) y las lecturas limpias se alinearon con el genoma de referencia del ganso. Las lecturas mapeadas resultantes para cada muestra se ensamblaron utilizando StringTie (v1.3.3b) de manera guiada por referencia (24). Finalmente, el valor de FPKM (fragmentos por kilobase de transcripción por millón de lecturas mapeadas) para cada gen se calculó en función de la longitud del gen y el recuento de lecturas mapeadas. Los genes expresados diferencialmente (DEG) se identificaron utilizando el paquete DESeq2 R (v1.20.0). Los genes con un cambio absoluto de log2 ≥ 1 y un valor de p ajustado ≤ 0,05 se consideraron expresados diferencialmente. Los análisis de enriquecimiento de vías de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) de los DEG se realizaron utilizando el paquete clusterProfiler R.
Análisis metabolómico
Se mezcló una alícuota de 100 µL de cada muestra con 400 µL de solución de extracción (MeOH:ACN, 1:1, v/v), que contenía estándares internos deuterados. La mezcla se agitó durante 30 s, se sonicó durante 10 minutos en un baño de agua con hielo y luego se incubó durante 1 hora a -40 ° C para precipitar las proteínas. Luego, las muestras se centrifugaron a 12.000 rpm (RCF = 13.800 × g, r = 8,6 cm) durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante se transfirió a un vial de vidrio nuevo para su análisis. La muestra de control de calidad (QC) se preparó combinando alícuotas iguales del sobrenadante de todas las muestras individuales.
Para los metabolitos polares, los análisis LC-MS/MS se realizaron utilizando un sistema UHPLC (Vanquish, Thermo Fisher Scientific) equipado con una columna de amida Waters ACQUITY UPLC BEH (2,1 mm × 50 mm, 1,7 μm) acoplada a un espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 120 (Thermo Fisher Scientific). La fase móvil consistió en (A) 25 mmol/L de acetato de amonio y 25 mmol/L de hidróxido de amonio en agua (pH = 9,75) y (B) acetonitrilo. La temperatura del muestreador automático se mantuvo a 4 °C y el volumen de inyección fue de 2 μl. Los espectros de MS/MS se adquirieron utilizando un modo de adquisición dependiente de la información (IDA) controlado por el software Xcalibur (Thermo), que evalúa continuamente el espectro de MS de escaneo completo. Las condiciones de la fuente de ionización por electropulverización (ESI) se establecieron de la siguiente manera: caudal de gas envolvente, 50 arb; caudal de gas auxiliar, 15 arb; temperatura capilar, 320 °C; resolución completa de MS, 60.000; Resolución MS/MS, 15.000; energía de colisión, escalonada NCE 20/30/40; y voltaje de pulverización, 3,8 kV (positivo) o −3,4 kV (negativo).
Los datos sin procesar se convirtieron al formato mzXML usando ProteoWizard y luego se usó el software XCMS para la alineación de picos, la corrección del tiempo de retención y la extracción del área de picos. Los datos extraídos por XCMS se utilizaron primero para la identificación de la estructura de los metabolitos y el preprocesamiento de datos, luego para la evaluación de la calidad de los datos experimentales y, finalmente, para el análisis de datos. Bases de datos y repositorios públicos locales autoconstruidos, incluida la base de datos del metaboloma humano (HMDB) (http://www.hmdb.ca), Metlín (http://metlin.scripps.edu), MassBank (http://www.massbank.jp/), y mzCloud (https://www.mzcloud.org), se utilizaron para la búsqueda en bases de datos. Los metabolitos en las muestras biológicas se identificaron estructuralmente comparando sus tiempos de retención, masas moleculares (con un error de masa de <10 ppm), espectros de fragmentación secundaria, energía de colisión y otra información relevante con las bases de datos. Luego se analizaron los resultados de la identificación. Los metabolitos identificados en el nivel 2 o superior se sometieron a un análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) para identificar posibles variables de biomarcadores. Se determinaron metabolitos significativamente diferentes entre grupos en función de una importancia variable en la proyección (VIP) ≥ 1 y un valor de P ajustado ≤ 0,05. El análisis de agrupamiento jerárquico se realizó utilizando R (http://www.r-project.org/).
Aislamiento de ARN total y PCR cuantitativa en tiempo real.
Se utilizó Trizol (Invitrogen) para aislar el ARN total de GC cultivados hasta la etapa F1 a las 48 h. El ARN se transcribió de forma inversa en ADNc utilizando un kit de reactivos PrimeScript™ RT (TaKaRa, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuantitativo…
