Resumen
Antecedentes/Objetivos
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es una de las neoplasias malignas más mortales debido a su naturaleza agresiva y resistencia al tratamiento. La transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) impulsa la progresión del cáncer, regulada por factores de transcripción (TF) como SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2 y TWIST. Este estudio evalúa la expresión de EMT-TF en PDAC y su relevancia clínica.
Métodos
Se analizaron tejidos PDAC de 45 pacientes mediante qRT-PCR y Western blot. Las características clínicas y los resultados de supervivencia se examinaron estadísticamente para determinar las correlaciones con los niveles de EMT-TF.
Resultados
Los niveles de ARNm de SNAI1 (16,4 veces, p = 0,02), SNAI2 (21,8 veces, p = 0,028), ZEB1 (17,2 veces, p = 0,037) se elevaron significativamente en los tejidos PDAC en comparación con los controles sanos. TWIST mostró un aumento de 3,75 veces en el tejido PDAC; sin embargo, esta elevación no fue significativa (p = 0,124). Se observaron aumentos correspondientes en el nivel de proteína para Snail1/Slug y Zeb1. La expresión alta de SNAI1 se correlacionó con la invasión peripancreática (p = 0,026), mientras que la sobreexpresión de ZEB1 se asoció significativamente con una supervivencia más corta (15,2 frente a 33,3 meses, p = 0,037) y siguió siendo un factor pronóstico independiente en el análisis multivariado. El ARNm de ZEB2 se redujo, sin embargo, los niveles de proteína se elevaron. La sobreexpresión del ARNm de TWIST no se reflejó a nivel de proteína.
Conclusiones
La sobreexpresión de los factores de transcripción EMT SNAI1 y ZEB1 refleja patrones histopatológicos más agresivos de PDAC. La fuerte correlación de la expresión de SNAI1 con la expresión de otros EMT-TF resalta su papel en la invasión peripancreática, así como el impacto en la supervivencia general y puede servir como argumento para definir el papel principal de SNAI1 en este contexto.
Introducción
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) sigue siendo uno de los tumores más mortales con una tasa de supervivencia a 5 años del 7 al 11% (1). La mayoría de los pacientes son diagnosticados en etapas avanzadas de la enfermedad y sólo los pacientes sometidos a resección curativa por cáncer de páncreas tienen una tasa de supervivencia total de entre el 15% y el 20%.2). Una mejor comprensión de la genética, la epigenética, la metabolómica y la interacción intercelular aún no genera beneficios clínicamente significativos para los pacientes con adenocarcinoma de páncreas.
La agresividad del tumor está altamente asociada con la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) que contribuye a la quimiorresistencia, metástasis y recurrencia.3). La transición epitelial a mesenquimatosa es un proceso biológico reversible en el que las células epiteliales pierden sus características únicas de polaridad apicobasal y generalmente se entiende como plasticidad epitelial-mesenquimal.4). Este evento fisiológico se observa durante la embriogénesis (tipo I), pero también ocurre en la fibrosis (tipo II) y en la metástasis del cáncer (tipo III) (5). La EMT se caracteriza por la pérdida de uniones entre células y de la polaridad apico-basolateral, lo que resulta en la formación de células mesenquimales migratorias con propiedades invasivas. A lo largo de los fenómenos EMT, las células cancerosas adquieren la capacidad de migrar, resistir agentes terapéuticos, escapar de la inmunidad y formar nuevas colonias. La EMT está regulada en múltiples niveles: transcripcional, traduccional, de estabilidad de proteínas y epigenético. Los inductores de EMT conducen a la expresión y activación funcional de reguladores centrales, incluidos, entre otros, tres grupos principales de factores de transcripción activadores de EMT (EMT-TF): la familia Snail de factores de transcripción con dedos de zinc Snail/Slug codificados por SNAI1 y SNAI2, la familia de factores de transcripción homeobox (ZEB) de unión a caja E con dedos de zinc ZEB1/ZEB2, y la familia Twist de hélice-bucle-hélice básica (bHLH) factores de transcripción TWIST1/TWIST2 (6).
Estudios recientes y modelos experimentales han revelado que la EMT en el cáncer de páncreas es desencadenada principalmente por Zeb1, lo que promueve la plasticidad celular y desempeña un papel clave en la diseminación temprana de PDAC (7–9). Sin embargo, ninguno de los promotores EMT conocidos demostró tener un impacto significativo en la supervivencia de los pacientes con PDAC. La familia de los caracoles parece estar en la cadena principal que activa el proceso EMT y desempeña un papel importante en la diseminación temprana y la progresión de otros tipos de cáncer como el gástrico, el de mama o el de colon (10–12).
El conocimiento sobre cómo el proceso de EMT afecta la supervivencia de los pacientes con PDAC es limitado. Hay estudios que demuestran que los EMT-TF influyen en la diseminación temprana, la recurrencia local y la quimiorresistencia de un PDAC; sin embargo, no se sabe que ninguno de los EMT-TF sea superior. El objetivo de este estudio fue investigar los patrones de expresión y la relevancia clínica de los EMT-TF en pacientes con PDAC sometidos a resección curativa.
Materiales y métodos
Población de estudio y recogida de muestras de tejido.
Se obtuvo tejido PDAC de 45 pacientes que se sometieron a pancreatoduodenectomía en el centro de referencia terciario entre 2011 y 2020. A todos los pacientes se les diagnosticó PDAC en la cabeza del páncreas y no tenían antecedentes de otras neoplasias malignas. El diagnóstico fue confirmado mediante la evaluación histológica de rutina de las piezas quirúrgicas. La estadificación del tumor se realizó de acuerdo con la séptima edición del AJCC (2010), que fue aplicable durante el período de estudio (2011-2017). La invasión peripancreática se definió histológicamente como la infiltración de tejido graso peripancreático más allá del parénquima pancreático. Todos los pacientes fueron remitidos para quimioterapia adyuvante basada en gemcitabina de acuerdo con las directrices de tratamiento nacionales del período de estudio. No se incluyeron pacientes con quimioterapia neoadyuvante en este estudio. Se extrajo tejido pancreático sano de seis donantes de órganos múltiples que no tenían antecedentes de cáncer. La edad promedio de los donantes fue de 52 años (3 hombres, 3 mujeres) y todas las causas de muerte no fueron malignas (lesión cerebral traumática o hemorragia intracraneal). Para el análisis qRT-PCR, las muestras de tejido recién extraídas se colocaron en RNALater (Ambion; Huntingdon, Reino Unido), mientras que los tejidos para la extracción de proteínas se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido en el quirófano tras la extirpación quirúrgica y se mantuvieron a -80 °C hasta su uso. La aprobación ética fue emitida por el Comité de Ética de la Universidad de Ciencias de la Salud de Lituania (Nº BE-2–10). Se obtuvo de todos los pacientes o de sus representantes legales el consentimiento por escrito para el uso de muestras de tejidos y datos de seguimiento con fines de investigación. Los pacientes fueron seguidos hasta la muerte o el último contacto. Debido a que no siempre se pudo determinar de manera confiable la causa principal de muerte, solo se analizó la supervivencia general (SG).
Extracción de ARN y PCR con transcripción inversa.
La extracción de ARN total se realizó a partir de tejidos y utilizando el kit PureLink RNA easy (Ambion) y reactivos TRI (Zymo), según el protocolo del fabricante sin tratamiento con ADNasa. El ARN purificado se cuantificó y se evaluó su pureza mediante espectrofotometría UV (NanoDrop). Se generó ADN complementario (ADNc) a partir de 2 μg de ARN con el kit de ARN a ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). La amplificación del ARN específico se realizó en una mezcla de reacción de 20 µL que contenía 2 µL de plantilla de ADNc, 1 x mezcla maestra de PCR y los cebadores. El análisis cuantitativo de transcripción inversa-PCR (qRT-PCR) se realizó utilizando el sistema rápido de PCR en tiempo real ABI 7500 (Applied Biosystem). Para la normalización, se utilizó el gen de mantenimiento GAPDH. La cuantificación relativa se realizó utilizando el 2– ∆∆Ct método.
ensayo de transferencia Western
Las células enteras se lisaron utilizando el tampón de lisis RIPA con inhibidores de proteasa (Roche) y se centrifugaron a 10000 x g durante 10 minutos. Se analizó la concentración de proteínas de los sobrenadantes con un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific). Las muestras de proteínas se calentaron a 97 °C durante 5 minutos antes de la carga y 50 μg de las muestras se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 4%-12% (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) durante 50 minutos a 20 V. Las membranas se bloquearon con un tampón de bloqueo (Invitrogen) durante 30 minutos a temperatura ambiente y se incubaron. durante la noche a 4°C con anticuerpos primarios: 1:1000 anti-Snail monoclonal de ratón+SLUG de Abcam (ab180714), 1:5000 anti-Zeb1 monoclonal de conejo de Abcam (ab124512), 1:1000 anti-Zeb2 monoclonal de conejo de Abcam (ab223688), 1:1000 anti-TWIST monoclonal de conejo (ab175430) y anti-GAPDH monoclonal de ratón 1:10000 de Ambion (AM4300). Las membranas se lavaron y se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa apropiado (Invitrogen; anti-ratón o anti-conejo) durante 30 minutos, se lavaron y se incubaron con un kit de detección/sustrato de quimioluminiscencia (Invitrogen). Los resultados se analizaron con un sistema de documentación automatizado (Biorad).
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad (versión 8.2; GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). Los datos se presentan como media ± DE de tres o más experimentos independientes. Se utilizó una prueba no paramétrica de Mann-Whitney para la comparación entre grupos. El análisis multivariado se realizó mediante el modelo de regresión proporcional de Cox. Se utilizó la prueba de correlación de rangos de Spearman para determinar la correlación entre diferentes TF de EMT. La significación estadística se definió como p < 0,05.
Resultados
Características de los pacientes.
La mediana de edad de los pacientes fue de 68 años (rango 44-87). La evaluación histopatológica reveló que la mayoría de los pacientes tenían tumores T3 (64,4%) y G1-G2 bien a moderados diferenciados (60%). Se detectaron ganglios linfáticos metastásicos regionales (N1) e invasión peripancreática en el 68,9% de los casos. La invasión microvascular (V1) estuvo presente en el 66,7% y la invasión perineural en el 64,4% de los casos. La mediana del tiempo de seguimiento fue de 96,8 meses y la mediana de supervivencia fue de 30,2 meses. Todos los datos descriptivos del grupo de estudio se presentan en Tabla 1.
Los factores de transcripción EMT muestran una sobreexpresión diferencial en PDAC en comparación con el tejido pancreático sano
La comparación de los niveles de expresión de EMT-TF entre PDAC y tejido pancreático sano reveló niveles de ARNm significativamente elevados de SNAI1, SNAI2, ZEB1 y TWIST en tejido de cáncer de páncreas, mientras que la expresión de ZEB2 fue mayor en tejido pancreático normal (p <0,05) (Higo 1). Además, el ensayo de transferencia Western reveló niveles elevados de proteína de Snail1/Slug, Zeb1 y Zeb2 en comparación con el tejido pancreático normal, mientras que la expresión de Twist fue imperceptible (Higo 2). SNAI1, SNAl2 y ZEB1 se sobreexpresaron a nivel de ARNm (16,4 veces, 21,8 veces y 17,2 veces respectivamente) y a nivel de proteína en el tejido canceroso en comparación con el tejido pancreático normal. La expresión del ARNm de ZEB2 fue 1,7 veces menor en el tejido canceroso en comparación con el tejido pancreático normal, pero se determinaron cantidades más altas de proteína en el análisis de transferencia Western. La expresión de ARNm de TWIST fue 3,75 veces mayor en pacientes con PDAC, pero no pudimos determinar ninguna expresión de proteínas en el análisis de transferencia Western (higos 1 y 2).
El análisis qRT-PCR mostró niveles de ARNm significativamente elevados de SNAI1, SNAI2, ZEB1 y TWIST en tejido PDAC, mientras que la expresión de ZEB2 fue mayor en tejido pancreático normal.
El análisis de transferencia Western confirmó un aumento de los niveles de proteína de Snail1/Slug, Zeb1 y Zeb2 en PDAC, mientras que la expresión de la proteína Twist fue indetectable a pesar de sus elevados niveles de ARNm.
