Resumen
El entrenamiento ejercicio induce adaptaciones musculares que son altamente específicas para el tipo de ejercicio. Para un estudio sistemático de las adaptaciones de ejercicio diferenciadas en un nivel de ratón de nivel molecular, se han utilizado con éxito. El objetivo del estudio actual fue desarrollar un modelo de ratón adecuado de entrenamiento del ejercicio de fuerza isométrica caracterizada por adaptaciones específicas conocidas por el entrenamiento de fuerza. Los ratones C57BL/6 realizaron un entrenamiento de fuerza isométrico (ST) durante 10 semanas 5 días/semana. Además, se utilizaron un grupo de control sedentario (TC) o un grupo de entrenamiento de resistencia regular (ET) como controles. La capacidad de rendimiento se determinó por el tiempo de mantenimiento máximo (MHT) y la espirometría de la cinta de correr, respectivamente. Además, los tipos de fibra muscular y el diámetro, la concentración muscular de la fosfofructoquinasa 1 (PFK), la succinato deshidrogenasa (SDHA) y el transportador de glucosa tipo 4 (GLUT4) se determinaron. En un enfoque adicional, el efecto de ST sobre la intolerancia a la glucosa se probó en ratones diabéticos. En ratones del grupo ST, observamos un aumento de MHT en las pruebas de resistencia isométrica, una hipertrofia de fibra tipo II y un mayor contenido de proteína GLUT4 en la fracción de membrana. En contraste, en ratones del grupo ET un aumento de VO2maxse midió un cambio al tipo de fibra muscular oxidativa y se midió un aumento del contenido de enzimas oxidativas. Además, el entrenamiento de fuerza fue efectivo para reducir la intolerancia a la glucosa en ratones alimentados con una dieta alta en grasas. Se desarrolló y evaluó un modelo efectivo de entrenamiento de fuerza murina, que reveló marcadas diferencias en las adaptaciones conocidas por el entrenamiento de resistencia. Este enfoque también parece adecuado para probar los efectos terapéuticos del entrenamiento de fuerza.
Introducción
El cuerpo humano es un sistema altamente dinámico y plástico con respecto a las respuestas de adaptación al ejercicio. Dependiendo del tipo de tejidos de tensión de ejercicio, demuestran una mejora de sus propiedades funcionales, estructurales y/o metabólicas. Por lo tanto, los estímulos de entrenamiento de resistencia pura y de fuerza representan dos extremos importantes que se implementan en muchos regímenes de entrenamiento tanto en deportes de alto rendimiento como recreativos (1), (2)El fenotipo de resistencia se caracteriza por una alta resistencia contra la fatiga y una recuperación rápida después del ejercicio. Además, los músculos están enriquecidos con fibras de contracción lenta (fibras tipo I), y están abundantemente amuebladas con enzimas oxidativas y mitocondrias que permiten episodios prolongados de actividades de resistencia (3), (4). En contraste, los atletas de entrenamiento de resistencia son hipermusculares pero delgados. Exhiben una mayor resistencia máxima y pueden realizar programas de ejercicio de alta intensidad a corto plazo. Sus músculos están enriquecidos con fibras glucolíticas rápidas que expresan proteínas de cadena pesada de miosina (MHC) Tipo IIA e IIX. Estas fibras expresan principalmente enzimas glucolíticas para mejorar la utilización de glucosa y la generación de ATP. Sin embargo, estos músculos solo tienen una resistencia limitada contra la fatiga (3), (5).
Más allá del entrenamiento del ejercicio de rendimiento de los atletas se ha convertido en un factor de estilo de vida importante que se sabe que es efectivo en la prevención y la terapia de muchas enfermedades relacionadas con la riqueza, como muchas enfermedades metabólicas y cardiovasculares (6), (7). Mientras que las recomendaciones de entrenamiento recreativo se centraron durante mucho tiempo en el ejercicio de resistencia solo recientemente otras propiedades motoras, como la resistencia, se han evaluado con más detalle. Como muchos efectos del entrenamiento del ejercicio en prevención y terapia se basan en la adaptación muscular funcional y estructural, los trabajos recientes demostraron un papel importante tanto para la resistencia como para el entrenamiento de resistencia/resistencia en la prevención y la terapia de la obesidad y la diabetes tipo I (8), (9). En consecuencia, hay dos enfoques diferentes para abordar la disfunción metabólica en el músculo esquelético: el entrenamiento del ejercicio de resistencia promueve una mayor glucosa y oxidación de ácidos grasos y biogénesis mitocondrial y entrenamiento de ejercicios de resistencia para aumentar la masa muscular, la tasa metabólica básica y la actividad de las fibras glicolíticas (9), (10).
Para un estudio sistemático de los efectos del ejercicio en un nivel molecular, los modelos animales se han utilizado con éxito. Si bien los modelos de ejercicio de resistencia se han establecido y ampliamente informados en la literatura, el uso de modelos de ejercicio de resistencia/resistencia sigue siendo raro (11). Klitgaard (1988) y Nicastro et al. (2012) describieron modelos de roedores de ejercicio de resistencia que dieron como resultado adaptaciones específicas conocidas de los humanos. Sin embargo, estos enfoques experimentales mostraron algunas limitaciones en las extrapolaciones a las condiciones humanas o utilizaron aparatos de entrenamiento complejos (12), (13). Del mismo modo, los modelos publicados recientemente utilizaron la carrera de ruedas cargadas que se pueden caracterizar más como un tipo de entrenamiento combinado de resistencia a la resistencia (14)Por lo tanto, el objetivo del estudio actual fue desarrollar un modelo de ejercicio de resistencia/fuerza murina que pueda caracterizarse por un manejo simple y respuestas de adaptación adecuadas. Presumimos que este entrenamiento de fuerza isométrico regular resultó en adaptaciones específicas funcionales, estructurales y bioquímicas conocidas por el entrenamiento con ejercicio de resistencia en humanos y que se distinguirían claramente al entrenamiento de resistencia. Sabiendo que el ejercicio de resistencia en humanos también es efectivo en la terapia de la diabetes, planteamos la hipótesis de que este método de entrenamiento está reduciendo la intolerancia a la glucosa en un modelo de obesidad de ratón.
Métodos
Declaración de ética
Este estudio se realizó en estricta conformidad con las recomendaciones en la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los animales fueron alojados, atendidos, y el protocolo fue aprobado por el Oficial de Bienestar Animal de la Universidad Justus-Liebig y el Regierungspräsidium Giessen (No. 94/2010).
Animales y grupos experimentales
30 ratones machos C57BL/6N (de 10 a 12 semanas de edad) se asignaron a un grupo de entrenamiento de fuerza (ST), un grupo de entrenamiento de resistencia (ET) y un grupo de control (CT). Los pesos corporales iniciales se pueden encontrar en Tabla 1. Los ratones fueron alojados de 4 a 6 por jaula a 21 ± 1 ° C en jaulas estándar con acceso libre a alimentos y agua del grifo y fueron criados en la instalación de animales del Departamento de Medicina Deportiva (Justus-Liebig-University, Giessen).
Para investigar los efectos del entrenamiento del ejercicio sobre la diabetes y la obesidad, se establecieron 3 grupos adicionales (3 grupos, n = 10 cada uno, la misma edad y peso que otros grupos): grupo de control de grasa de alta grasa (HFCT), un grupo de entrenamiento de alta resistencia a la grasa (HFET) y un grupo de entrenamiento de alta resistencia a la grasa (HFST). Los grupos de dieta alta en grasas se cambiaron durante 10 semanas en una dieta de manteca para inducir la obesidad como se describió anteriormente. (15).
Protocolos de entrenamiento para ejercicios
Todos los animales fueron alojados en un ciclo inverso de luz oscura (iluminación de 21:00 a 09:00 h). El entrenamiento de fuerza isométrica se realizó mediante la siguiente configuración experimental. Se cortó un orificio de 8 × 5 cm en una placa de aluminio (AE) y se cubrió con una malla de alambre de metal. El cable tenía un diámetro máximo de 1 mm para proporcionar a los ratones un agarre fuerte. Los ratones se apoderaron de sus patas delanteras y traseras sobre cables horizontales de la malla de metal y la placa se colocó en una posición vertical (Fig. 1). Mientras tanto, la orientación de los ratones estaba sosteniendo la cabeza hacia arriba. La superficie simple de la placa AE evitó un movimiento adicional. El entrenamiento de fuerza se realizó durante 5 veces/semana durante 3 minutos y 3 series. La ruptura entre cada serie fue de 1 minuto.
Los ratones del grupo ET realizaron una carrera de cinta de correr durante 35 minutos/día a 12 m/min, 5 veces por semana, durante 10 semanas. La velocidad de carrera fue de 0.27 ± 0.05 m/s correspondiente a aproximadamente el 80% de VO2max.
Prueba de resistencia funcional y resistencia
Para determinar la fuerza isométrica, utilizamos la misma configuración experimental como en el protocolo de entrenamiento (tiempo máximo de retención = MHT). Brevemente, los ratones se apoderaron de sus patas sobre cables de la malla de metal y la placa se colocó en una posición vertical. El tiempo se midió hasta que los ratones liberaron ambas patas traseras del cable.
La capacidad aeróbica se determinó utilizando una espirometría de cinta de correr como se describió anteriormente (16), (17). Brevemente, después de una breve aclimatización, consumo de oxígeno máximo (VO2max) y la velocidad máxima de carrera (vmáximo) de ratones se probaron al menos 4 días antes de comenzar los experimentos. Después de 10 minutos de aclimatación en la cámara de la cinta de correr, los ratones realizaron una prueba de ejercicio continua y progresiva hasta el agotamiento. La absorción de la prueba comenzó a 0.15 m/seg, cada 3 minutos la velocidad aumentó en 0.05 m/seg VO2máximo y Vmáximo fueron analizados.
Tipificación de fibra y determinación del diámetro muscular
Secciones transversales en serie (20 µm de espesor) de m. recto femoral, m. SOLEUS Y M. El gastrocnemio se cortó en un microtomo de criostato a -25 ° C. Las secciones transversales musculares se montaron en resbalones de cubierta y se tiñeron para la ATPasa de miosina (MATPasa) con preincubación ácida utilizando un método modificado según Hämäläinen y Pette (18). Briefly, las secciones se incubaron preincubadas durante 5 minutos en acetato de sodio (54.3 mM)-solución barbital de sodio (32.6 mM) ajustada con HCl al pH 4.6. Después del lavado, las secciones se incubaron durante 30 minutos a 37 ° C en solución de sustrato (ATP 2,7 mM, 100 mmglicina, 54 mM CaCl2100 mmnacl, pH ajustado a 9.6). Después de incubaciones en CaCl de 11 mm2 y 2% cocl2se desarrolló un compuesto insoluble negro en sulfuro de amonio al 1% durante 50 s. Por lo tanto, las fibras «negras» tipo I se pueden distinguir de las fibras «grises» tipo II. Después de lavar con agua destilada, las secciones se analizaron mediante microscopía óptica (Leica DMI 6000B, Leica Microsystems, Wetzlar Alemania) para calcular los porcentajes de fibra Tipo I y Tipo II y la medición de los diámetros de fibra muscular promedio mediante el uso de software de suite Leica y Leica Qwin (microsistemas de Leica, Wetzlar Alemania).
Aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y reacción en cadena de polimerasa en tiempo real
La preparación del análisis de la expresión del tejido y el gen se realizó como se describió anteriormente (19). El ARN de mensajero total se aisló de los músculos de ratón homogeneizados (M 1 µg de ARN aislado cada uno se convirtió en ADNc mediante transcripción inversa utilizando el kit de síntesis de ADNm Las condiciones para la transcripción inversa fueron las siguientes: 1 ciclo a 25 ° C durante 5 min; 1 ciclo a 42 ° C durante 30 min; 1 ciclo a 85 ° C durante 5 min.
La cuantificación relativa del transportador de glucosa tipo 4 (GLUT4), la fosfofructoquinasa (PFK) y la subunidad de succinato deshidrogenasa A (SDHA) se realizó mediante PCR en tiempo real con la supermix IQ Sybr Green de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Biorad, Munich, Alemania). Por reacción, se usó una mezcla de 25 µl que contenía 12.5 µl de IQ SYBR Green Supermix, 0.5 µl de avance hacia adelante e inverso, 9.5 µl de agua estéril y 2 µl de la plantilla de ADN complementaria diluida de 1∶5. Se realizó un control negativo (control no plantado) en cada ejecución. Los experimentos de PCR en tiempo real se realizaron con un MX3000P (Stratagene, Heidelberg, Alemania) en las siguientes condiciones: 1 ciclo a 95 ° C durante 10 min, luego 40 ciclos a 95 ° C durante 10 s, 59 ° C durante 10 s, 72 ° C durante 10 s, seguido de una curva de disociación. Los cebadores de intrón se diseñaron utilizando información de secuencia de la base de datos NCBI. Los valores de CT se normalizaron al control endógeno (Porfobilinogendeaminasa, PBGD).
Se utilizaron los siguientes cebadores:
Phosfk_mouse_f 5′-AGGGGAAGGGCATCTTTGAT-3 ‘
Phosfk_mouse_r 5′-AGTCAGGGGTGTTGGCAAAG-3 ‘
Glut4_mouse_f 5′-CGGGTTTCCAGCAGATCG-3 ‘
Glut4_mouse_r 5′-GGGCATTGATACCCCAATG-3 ‘
