Resumen
Más del 90% de los pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) involucran KRAS mutaciones (KRASmut), para el cual las opciones de tratamiento actuales son limitadas. Las estatinas, comúnmente utilizadas para reducir el colesterol, han demostrado cierta toxicidad selectiva hacia KRAS-células transformadas, lo que generó la pregunta de si los conjugados basados en estatinas podrían lograr una absorción selectiva específicamente en KRASmut células. Para investigar esto, sintetizamos conjugados de estatina y colorante uniendo un tinte fluorescente (Cy5.5) a dos estatinas: simvastatina y pravastatina, con el objetivo de evaluar si realmente se produce una absorción selectiva. Nuestros hallazgos revelaron que estos conjugados exhibieron una absorción notablemente mejorada en KRASmut células en comparación con KRAS tipo salvaje (KRASpeso) células. Evaluamos la absorción de estos conjugados en ambos KRASmut y KRASpeso células y examinó su potencial para apuntar selectivamente KRASmut Células de cáncer de páncreas (PCC) utilizando un modelo de tumor PDAC diseñado cocultivado con PCC y fibroblastos asociados al cáncer (CAF). Nuestros hallazgos indican que KRASmut las células cancerosas exhibieron una mayor absorción de conjugados de estatina-Cy5.5 a través de macropinocitosis mejorada en comparación con KRASpeso células cancerosas y CAF. También encontramos una mayor absorción del conjugado estatina-Cy5.5 en células MCF10A con PTEN deficiencia, una condición conocida por elevar la macropinocitosis, en comparación con las células de control MCF10A con tipo salvaje PTEN. En particular, en el modelo de cocultivo de PCC y CAF, el conjugado pravastatina-Cy5.5 eliminó selectivamente KRASmut PCC sin afectar la KRASpeso CAF. Estos hallazgos resaltan el potencial sinérgico único de la estatina-Cy5.5 (distinto de cualquiera de los componentes por separado) como vehículos de administración específicos para KRASmut terapia contra el cáncer.
Introducción
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer en los Estados Unidos, con una tasa de supervivencia a cinco años de sólo el 12% (1). La naturaleza agresiva del PDAC y su resistencia a los tratamientos convencionales, como la quimioterapia, la radioterapia, la terapia dirigida y la inmunoterapia, subrayan la necesidad urgente de nuevos enfoques terapéuticos. El microambiente tumoral (TME) del PDAC es particularmente complejo y consta de células de cáncer de páncreas (PCC), fibroblastos asociados al cáncer (CAF) y varias células inmunitarias, lo que complica aún más el tratamiento.2). En consecuencia, las opciones de tratamiento actuales suelen ser inadecuadas y se necesitan estrategias novedosas para mejorar los resultados de los pacientes.
Una característica clave del PDAC es la alta prevalencia de KRAS mutaciones, presentes en más del 90% de los pacientes con PDAC (3). Estas mutaciones juegan un papel crucial en impulsar la tumorigénesis al mantener KRAS en un estado continuamente activo, promoviendo el crecimiento y la división celular incontrolados. Esta señalización persistente contribuye al comportamiento agresivo y al mal pronóstico del cáncer, lo que hace que KRAS un objetivo importante para la terapia contra el cáncer. Los avances recientes se han mostrado prometedores; por ejemplo, el KRASG12C El inhibidor sotorasib (AMG 510) demostró resultados prometedores en el ensayo clínico de fase I para el cáncer de pulmón de células no pequeñas, observándose una respuesta parcial o enfermedad estable en el 88,1% de los pacientes con KRASG12C mutaciones (4,5). Además, un estudio reciente sugiere que KRASG12D Los inhibidores pueden ofrecer beneficios potenciales en el tratamiento del cáncer de páncreas (6). Sin embargo, la heterogeneidad de KRAS Las mutaciones, incluidos subtipos como G12C, G13D, G12D, G12V y G12R, presentan un desafío para desarrollar tratamientos que sean efectivos en todas las variantes (7). Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar terapias que puedan dirigirse eficazmente a la diversa gama de KRAS subtipos de mutación.
Curiosamente, las estatinas, ampliamente utilizadas para reducir el colesterol, han demostrado una eficacia selectiva para matar KRAS mutante (KRASmut) células in vitro y en modelos tumorales (5,8–10). Las estatinas inhiben la vía del mevalonato, que es necesaria para KRAS prenilación, una modificación postraduccional requerida para su localización en la membrana celular donde ejerce efectos oncogénicos (9,11–14). Al inhibir la prenilación, las estatinas alteran KRAS función, impidiendo su papel en la promoción del crecimiento tumoral (15). Esto plantea la cuestión de si los conjugados basados en estatinas también podrían lograr una absorción selectiva específicamente en KRASmut células.
Para investigar esto, sintetizamos conjugados de estatina y colorante uniendo un tinte fluorescente (Cy5.5) a dos estatinas, simvastatina y pravastatina, con el objetivo de evaluar si se produce una absorción selectiva. Hasta donde sabemos, ningún estudio previo ha examinado directamente la captación selectiva de conjugados de estatina y colorante fluorescente en KRASmut células, y tratamos de investigar el mecanismo de absorción de estos conjugados. Nuestros hallazgos revelaron que estos conjugados exhibieron una absorción notablemente mejorada en KRASmut células en comparación con KRAS tipo salvaje (KRASpeso) células.
Además, investigamos su capacidad para apuntar selectivamente KRASmut PCC que utilizan un modelo de tumor PDAC diseñado con cocultivos de PCC y CAF. Nuestros resultados mostraron que estos conjugados estatina-tinte fueron absorbidos selectivamente por KRASmut células en comparación con isogénicas KRASpeso células y CAF. También encontramos que los conjugados de estatina-Cy5.5 fueron absorbidos selectivamente en la eliminación de PTEN (PTENKO) células a través de macropinocitosis. Además, el conjugado pravastatina-Cy5.5 mostró una muerte selectiva modesta hacia las PCC en un modelo de cocultivo 3D. Esto sugiere que la conjugación de estatinas con Cy5.5 crea un compuesto único con absorción selectiva en KRASmut células, un efecto que no se observa con estatinas o Cy5.5 solos, lo que demuestra el potencial terapéutico de tales conjugados. Estos hallazgos subrayan la sinergia funcional del conjugado estatina-Cy5.5 y respaldan su potencial como prototipo para KRASmut-entrega selectiva de fármacos.
Materiales y métodos
Síntesis de conjugados estatina-tinte.
Simvastatina-Cy5.5: Se añadió ácido Cy5.5 (15 mg, 0,026 mmol, Lumiprobe, MD, EE. UU.) a una mezcla de simvastatina (11 mg, 0,026 mmol), EDC (5,5 mg, 0,035 mmol) y DMAP (1,6 mg, 0,012 mmol) en diclorometano (DCM, 1 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, seguido de la evaporación del disolvente. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice usando DCM/metanol (19/1) como fase móvil. El producto final se obtuvo como un sólido azul. La masa y la pureza de simvastatina-Cy5.5 se confirmaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (1260 Infinity II; Agilent Technologies, CA, EE. UU.). La m/z calculada fue 983,6, con una m/z medida de 983,7. La pureza de simvastatina-Cy5.5 se analizó mediante HPLC en condiciones de gradiente de disolvente de acetonitrilo/H2O de 5:95 a 100:0 durante 30 min, seguido de 100:0 durante 5 min.
Pravastatina-Cy5.5: Una mezcla de pravastatina (20 mg, 0,045 mmol), EDC (14 mg, 0,090 mmol) y NHS (8,6 mg, 0,075 mmol) en dimetilformamida (DMF) se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Posteriormente, se añadió en una porción a la mezcla Cy5.5 amina (34 mg, 0,045 mmol, Lumiprobe, MD, EE. UU.). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, seguido de la evaporación del disolvente. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice usando DCM/metanol (4/1) como fase móvil. El producto final se obtuvo como un sólido azul. La masa de pravastatina-Cy5.5 se confirmó mediante desorción ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF, Voyager DE-STR; Applied Biosystems, CA, EE. UU.), con una m/z calculada de 1087,7 y una m/z encontrada de 1087,8. La pureza se confirmó mediante análisis de HPLC en condiciones de gradiente de disolvente de acetonitrilo/H2O de 5:95 a 100:0 durante 30 min, seguido de 100:0 durante 5 min).
Información sobre cultivos celulares y líneas celulares.
Las líneas celulares Panc1 (CRL-1469) y BxPC3 (CRL-1687) se adquirieron de la American Type Culture Collection. La línea celular Panc1 se cultivó en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen, MA, EE. UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS; Invitrogen, MA, EE. UU.) y solución antibiótica-antimicótica al 1 % (Thermo Fisher, MA, EE. UU.). Las células BxPC3 se mantuvieron en medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640; GenDEPOT, TX, EE. UU.) que contenía 10% de FBS y 1% de solución antibiótica-antimicótica.
El KRAS-Células epiteliales del conducto pancreático humano inducibles (HPDE). iKRAS) la línea celular fue amablemente proporcionada por el Dr. Allen-Petersen de la Universidad Purdue. HPDE iKRAS Las células fueron modificadas genéticamente para permitir la KRAS La mutación G12D será inducida por la presencia de doxiciclina. Los detalles sobre la modificación y caracterización de la línea celular se describen en Tsang et al (16). HPDE iKRAS Las células se mantuvieron en medio libre de suero de queratinocitos (Invitrogen, MA, EE. UU.) suplementado con extracto de pituitaria bovina (0,05 mg/ml), factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (5 ng/ml) y L-glutamina. Para KRAS inducción, HPDE iKRAS Las células se trataron con 25 ng/ml de doxiciclina durante 48 h (HPDE KRASmut), mientras que el HPDE iKRAS Las células se trataron con el correspondiente medio de control de dimetilsulfóxido (DMSO) para HPDE. KRASpeso en las condiciones normales de cultivo. El KRAS La inducción se procesó después de que las células fueron recolectadas y sembradas en las plataformas experimentales. CAF19 transducido con GFP mejorada fue amablemente proporcionado por la Dra. Melissa Fishel (17) donde las células CAF19 se obtuvieron originalmente del Dr. Anirban Maitra en la Universidad Johns Hopkins (18). Las células CAF19 se mantuvieron en DMEM suplementado con FBS al 10 % (v/v), suplemento GlutaMAX™ al 1 % (v/v) (Invitrogen, MA, EE. UU.) y 100 µg/ml de penicilina/estreptomicina. KRAS líneas celulares isogénicas HCT116 y DLD1 (KRASpeso y KRASPESO/G13D) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Bert Vogelstein del Johns Hopkins Kimmel Cancer Center al laboratorio del Dr. Jean Zhao (Tabla S1) (19).
Las células se recogieron regularmente con tripsina al 0,05 % y EDTA 0,53 mM (Life Technologies, CA, EE. UU.) cuando se cultivaron hasta aproximadamente un 80 % de confluencia en 25 o 75 cm.2 matraces T y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO2. Las células recolectadas se utilizaron para experimentos o se subcultivaron manteniéndolas dentro de los 15th paso.
Ensayo de absorción celular
Las células se sembraron en cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina (Neuvitro, WA, EE. UU.) a una densidad del 60 al 70%. Para el experimento de tratamiento con inhibidores, las células se preincubaron con DMSO (como simulacro) o diferentes inhibidores de señalización durante 1,5 h y se trataron con conjugados de estatina-tinte 50 nM durante 1 h. El inhibidor de señalización utilizado para el pretratamiento fue EIPA (50 μM, 1,5 h) para la inhibición de la macropinocitosis. Después de los tratamientos, las células se lavaron repetidamente con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4%. Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (Thermo Fisher, MA, EE. UU.) y los cubreobjetos se montaron en un portaobjetos de vidrio con medio de montaje (90 % glicerol/0,2 % galato de n-propilo/Tris 20 mM, pH 8,0). Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron mediante disco confocal giratorio en un microscopio de fluorescencia invertido.
Ensayo de citotoxicidad
La citotoxicidad de simvastatina-Cy5.5, pravastatina-Cy5.5 y Cy5.5 se determinó mediante el ensayo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS), que es un método colorimétrico para medir la proliferación celular (CellTiter 96® AQueous One Solution, Promega, WI, EE. UU.). Brevemente, las células se precultivaron en una placa de 96 pocillos durante 48 h para lograr una confluencia de aproximadamente el 60 %. Luego, las células se trataron con concentraciones variables (0, 0,05, 0,1, 1, 5, 10 μM) de simvastatina-Cy5.5, pravastatina-Cy5.5 o Cy5.5 durante 24 h. Para las soluciones de fármacos, se utilizó el medio de inducción que contenía 25 ng/ml de doxiciclina para el HPDE. KRASmut células, mientras que para el HPDE se utilizó un medio base que consistía en DMSO al 1%. KRASpeso células. Después de este tratamiento, se evaluó la proliferación celular utilizando la solución MTS según las instrucciones del proveedor. La viabilidad se midió cuantitativamente comparando los valores de absorbancia relativa con los de los respectivos grupos de control (0 μM) para cada tipo de célula.
Ensayo de captación celular utilizando el modelo T-MOC.
La absorción de los conjugados de estatina-tinte se evaluó en un modelo T-MOC cocultivo de PCC-CAF para investigar la respuesta diferencial en la acumulación de fármaco entre células PCC y CAF. El modelo T-MOC cocultivo era una plataforma de microfluidos para demostrar el transporte dinámico como se describe en nuestra publicación anterior…
