Resumen
Antecedentes
El receptor desencadenante expresado en las células mieloides-1 (TREM-1) es un potente amplificador de las respuestas inflamatorias y desempeña un papel fundamental en la patogénesis de diversas enfermedades infecciosas. En particular, la evidencia emergente sugiere que TREM-1 también participa en el desarrollo y la progresión de enfermedades cardiovasculares, como la aterosclerosis y la fibrilación auricular. Sin embargo, su papel en la lesión por isquemia/reperfusión (I/R) del miocardio aún no está claro. Este estudio tuvo como objetivo investigar el papel de TREM-1 en la lesión I/R del miocardio y explorar los posibles mecanismos moleculares subyacentes.
Métodos
Se estableció un modelo de hipoxia/reoxigenación (H/R) utilizando cardiomiocitos HL-1 sometidos a 6 horas de hipoxia seguidas de 6 horas de reoxigenación. Los niveles de piroptosis se evaluaron mediante tinción de Hoechst-PI, ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), ensayo CCK-8 y análisis de transferencia Western. In vivo, se estableció un modelo de lesión I/R miocárdica en ratones C57BL/6 sometiéndolos a 30 minutos de isquemia seguidos de 24 horas o 7 días de reperfusión. La evaluación se realizó mediante tinción TTC, transferencia Western, ecocardiografía, tinción histoquímica e inmunohistoquímica.
Resultados
En este estudio, encontramos que la expresión de TREM-1 estaba significativamente aumentada en modelos tanto in vitro como in vivo de lesión por isquemia-reperfusión miocárdica (MIRI). La inhibición farmacológica de TREM-1 por LR12 redujo efectivamente los niveles de piroptosis de cardiomiocitos y suprimió la activación de la vía de señalización NF-κB. Además, el tratamiento con LR12 alivió la inflamación y la fibrosis del miocardio y mejoró la función ventricular izquierda en ratones. Los experimentos de intervención con MCC950, un inhibidor específico de NLRP3, confirmaron que la inhibición de NLRP3 podría imitar el efecto antipiroptótico de LR12 y reducir la expresión de proteínas relacionadas con la piroptosis. Los experimentos de inmunofluorescencia verificaron además que la inhibición de NF-κB disminuyó la expresión de NLRP3, aclarando la asociación entre las señales posteriores de TREM-1 y NLRP3. Los experimentos de seguimiento a largo plazo mostraron que el tratamiento con LR12 redujo significativamente el área de fibrosis miocárdica 7 días después de la reperfusión.
Conclusión
Nuestros hallazgos indican que la inhibición de TREM-1 alivia la piroptosis de cardiomiocitos durante MIRI al suprimir la activación de la vía de señalización NF-κB. Por lo tanto, TREM-1 puede representar un objetivo terapéutico prometedor para el tratamiento de la lesión por isquemia-reperfusión miocárdica.
1. Introducción
El infarto de miocardio (IM) ha sido ampliamente reconocido como una de las principales causas de discapacidad y mortalidad en todo el mundo (1). La aplicación de trombólisis farmacológica o intervención coronaria percutánea (ICP) puede restaurar eficazmente el suministro de sangre a los cardiomiocitos, reduciendo así la lesión miocárdica y limitando el tamaño del infarto. Sin embargo, cabe señalar que el proceso de restauración de la perfusión coronaria suele ir acompañado de un fenómeno de lesión secundaria conocido como lesión por isquemia-reperfusión miocárdica (IRMI) (2).Se ha demostrado que esta afección no solo compromete la eficacia de las intervenciones terapéuticas sino que también exacerba el daño a tejidos y órganos (3).Dadas las graves consecuencias de MIRI, existe una necesidad urgente de desarrollar objetivos terapéuticos novedosos y eficaces.
La piroptosis es una forma de muerte celular inflamatoria programada caracterizada por una rápida ruptura de la membrana plasmática mediada por gasdermina D (GSDMD). Tras el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) o patrones moleculares asociados a daños (DAMP) por parte de los receptores de reconocimiento de patrones intracelulares, se desencadena el ensamblaje del inflamasoma. Específicamente, la activación de NLRP3 conduce a su reclutamiento de ASC, lo que a su vez facilita la activación de caspasa-1. La caspasa-1 activada escinde el GSDMD de longitud completa en sus fragmentos C-terminal y N-terminal. También procesa las citocinas proinflamatorias pro-IL-1β y pro-IL-18 en sus formas maduras IL-1β e IL-18. El fragmento N-terminal de GSDMD (GSDMD-N) luego forma poros en la membrana plasmática, lo que permite la liberación de estas citocinas inflamatorias, que amplifican aún más el daño celular.4,5). Estudios recientes han demostrado que la piroptosis está implicada en la patogénesis de diversas enfermedades cardiovasculares, incluido el infarto de miocardio, la lesión I/R del miocardio, la miocardiopatía y la insuficiencia cardíaca.6–9).
La activación inflamatoria es un contribuyente clave a la patogénesis de MIRI (10). El receptor desencadenante expresado en las células mieloides-1 (TREM-1), un receptor expresado en las superficies de las células mieloides, es un amplificador crucial de la señalización inflamatoria (11). La evidencia emergente ha puesto de relieve su participación en múltiples enfermedades cardiovasculares, incluidas la aterosclerosis, la fibrilación auricular y la miocardiopatía séptica (12–14). Se ha demostrado que TREM-1 modula vías inflamatorias como la activación de NF-κB y la piroptosis en diversos contextos patológicos.15). NF-κB es un regulador central de la inflamación (16,17), mientras que la piroptosis representa una forma de muerte celular programada asociada a la inflamación (18). Sin embargo, el patrón de expresión de TREM-1 durante MIRI y si el eje de señalización TREM-1/NF-κB participa en la regulación de la lesión I/R del miocardio aún no está claro.
En este estudio, utilizamos un modelo de cardiomiocitos de hipoxia/reoxigenación (H/R) in vitro y un modelo de ratón de isquemia/reperfusión (I/R) in vivo para investigar el papel de TREM-1 en MIRI, y exploramos más a fondo la participación del eje TREM-1/NF-κB en la piroptosis de cardiomiocitos.
2. Materiales y métodos
2.1. Construcción del modelo in Vitro H/R
Los cardiomiocitos HL-1 se cultivaron en medio MEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% y penicilina estreptomicina al 1%. Las células se sembraron en placas de 6 cm y se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37°C con 5% de CO2. Cuando la confluencia celular alcanzó aproximadamente el 80%, el medio de cultivo se reemplazó con MEM sin glucosa ni suero. Luego, las células se transfirieron a una incubadora trigas (95% N2, 5% CO2) durante 6 horas para inducir la hipoxia. Después de la hipoxia, las células se devolvieron a condiciones normóxicas en medio MEM estándar durante 6 horas de reoxigenación. El experimento se dividió en 4 grupos: ① Grupo de control: cultivado normalmente sin tratamiento H/R; ② Grupo control + LR12 (MCE,HY-P3211A): cultivado normalmente y pretratado con 5 μmol/l de LR12 durante 12 horas; ③ Grupo H/R: sometido a tratamiento H/R solo; ④ Grupo H/R + LR12: pretratado con 5 μmol/L de LR12 durante 12 horas antes del tratamiento H/R. Además, se creó un grupo H/R + PDTC (MCE,HY-18738): pretratado con 20 μmol/L de PDTC durante 12 horas antes del tratamiento H/R para verificar el papel de la vía NF-κB; y un grupo H/R + MCC950 (MCE,HY-12815): pretratado con 10 μmol/L de MCC950 durante 2 horas antes del tratamiento H/R para verificar el efecto de NLRP3 sobre la piroptosis.
2.2. ensayo CCK-8
Se sembraron células HL-1 en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 103 células por pocillo, con 5 pocillos replicados por grupo. Se añadió PBS alrededor de la placa para evitar la evaporación. Después de cultivar durante 12 horas para permitir la adhesión celular, las células se trataron según los grupos anteriores. Al final del tratamiento, se agregaron a cada pocillo 100 μL de medio MEM sin suero que contenía un 10% de reactivo CCK-8 (Biosharp, número de catálogo: ALX-850–039), seguido de una incubación a 37 °C en la oscuridad durante 1 hora. La absorbancia (valor de DO) a 450 nm se midió usando un lector de microplacas (adquirido en Tacan Company, Suiza). La viabilidad celular se calculó de la siguiente manera: Viabilidad celular = ((valor de DO del grupo experimental – valor de DO del grupo de control en blanco)/(valor de DO del grupo de control – valor de DO del grupo de control en blanco)) × 100%.
2.3. Ensayo de actividad LDH
Después del tratamiento de las células en cada grupo, los sobrenadantes del cultivo se recogieron y analizaron según las instrucciones del kit de detección de LDH (Beyotime Biotechnology, Shanghai, número de catálogo: C0017): se mezclaron 120 µl del sobrenadante con 60 µl del reactivo de detección, se incubaron a 37 °C en la oscuridad durante 30 minutos y se midió el valor de DO a 450 nm usando un lector de microplacas (adquirido en Compañía Tacan, Suiza). La tasa de liberación de LDH se calculó de la siguiente manera: Tasa de liberación de LDH = ((valor de DO del grupo experimental – valor de DO del grupo en blanco)/(valor de DO del grupo de control – valor de DO del grupo en blanco)) × 100%.
2.4. Tinción Hoechst 33342/PI
Se sembraron células HL-1 en placas de 24 pocillos y se cultivaron durante la noche. Después del tratamiento, las células se tiñeron con Hoechst 33342 (1:1000) durante 30 minutos en la oscuridad, seguido de fijación con paraformaldehído durante 15 minutos. Luego se añadió una solución de yoduro de propidio (PI) (1:1000) y se incubó durante 5 minutos. Las células se lavaron con PBS y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia. La observación se realizó bajo un microscopio de fluorescencia (comprado en Leika Company, Alemania): Hoechst 33342 tiñó los núcleos celulares de azul, mientras que PI tiñó las células con membranas celulares dañadas (células piroptóticas/necróticas) de rojo.
2.5. Modelo de isquemia/reperfusión (I/R) miocárdica in vivo
Se adquirieron ratones C57BL/6 macho de ocho semanas de edad de la Universidad Médica de Harbin. Se estableció un modelo de lesión por isquemia-reperfusión miocárdica abriendo el tórax a través de una pequeña incisión izquierda para exponer el corazón, ligando la arteria coronaria descendente anterior izquierda durante 30 minutos, seguido de 24 horas de reperfusión. Los ratones se dividieron en 3 grupos: grupo de control de operación simulada, grupo de isquemia-reperfusión (I/R) y grupo de tratamiento I/R + LR12. El régimen de tratamiento de LR12 fue el siguiente: se disolvieron 5 mg/kg de LR12 en 100 μl de solución salina normal, se inyectaron por vía intraperitoneal una vez cada 12 horas por un total de 2 veces antes del modelado, y se administró una inyección adicional 5 minutos antes de la reperfusión; durante la reperfusión, las inyecciones se administraron una vez cada 12 horas hasta que los ratones fueron sacrificados. Los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Harbin (número de aprobación: YJSDW2024-040), y todas las operaciones experimentales siguieron estrictamente las Directrices para la revisión ética de animales de experimentación (GB/T 35892-2018) y los requisitos de PLOS ONE con respecto a los criterios de valoración y el bienestar humano de los animales.
2.5.1. Cuidados preoperatorios y optimización de la anestesia para ratones.
Los ratones estuvieron en ayunas durante 12 horas antes de la cirugía con libre acceso al agua. Durante el ayuno, el ambiente de reproducción se mantuvo a 22 ± 1°C, una humedad relativa de 50 ± 5% y un ciclo de luz de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad para reducir el estrés ambiental. La anestesia se indujo mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 5% (50 mg/kg). Después de la inyección, se controlaron de cerca el reflejo corneal de los ratones y la respuesta de las extremidades a estímulos dolorosos (como pinzar la cola) para garantizar que la profundidad anestésica alcanzara el estándar de «reflejo corneal desaparecido y sin movimiento espontáneo de las extremidades», evitando el dolor intraoperatorio causado por una anestesia insuficiente. Si el efecto anestésico era deficiente (como espasmos de las extremidades durante la cirugía), se suplementaba 1/4 de la dosis inicial de pentobarbital sódico para mantener la anestesia intraoperatoria estable. Se utilizó un ventilador específico para roedores para la ventilación asistida (frecuencia respiratoria: 60 respiraciones por minuto, volumen corriente: 10 ml/kg). Durante la ventilación, se utilizó un instrumento de mantenimiento de la temperatura corporal (Chengdu TaiMeng Technology Co., Ltd., modelo: TP-2000) para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 ± 0,5 °C para prevenir lesiones por estrés causadas por la hipotermia.
2.5.2. Definición y seguimiento de puntos finales humanos.
En este estudio se predefinieron los siguientes criterios de valoración humanos. Si ocurría alguna de las condiciones, se realizaba la eutanasia inmediatamente para evitar un dolor excesivo en los ratones: incapacidad para comer o beber de forma independiente durante más de 1 hora durante el período de recuperación postoperatoria, con una pérdida de peso de más del 15% en 24 horas; anomalías respiratorias graves (frecuencia respiratoria > 100 respiraciones por minuto o < 30 respiraciones por minuto),...
