Resumen
Se han informado beneficios del ejercicio sobre la regeneración nerviosa y la recuperación funcional en los modelos de enfermedad del sistema nervioso central y periférico. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes de regeneración mejorada y mejores resultados funcionales se entienden menos. Utilizamos un modelo de regeneración nerviosa periférica que tiene una buena correlación entre los resultados funcionales y el número de axones motores que se regeneran para evaluar el impacto del ejercicio de la cinta de correr. En este modelo, el nervio mediano se transeccionó y reparó mientras se transeccionó el nervio cubital y se impidió la regeneración. El ejercicio diario de la cinta de correr dio como resultado una recuperación más rápida de la función de agarre de la extremidad anterior según lo evaluado por la potencia de agarre y la prueba de retención invertida. El ejercicio diario también dio como resultado una mejor regeneración según lo evaluado por la recuperación de potenciales de acción motora compuesta, un mayor número de axones en el nervio mediano y un tamaño de miofibra más grande en los músculos objetivo. Además, estas observaciones se correlacionaron con niveles más altos de factores neurotróficos, factor neurotrófico derivado de glial (GDNF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y el factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1), en suero, nervio y músculo sugiriendo que el aumento de los factores neurotróficos derivados de músculos puede ser responsable para mejorar la regeneración de la regeneración de la regeneración mejorada para mejorar la regeneración de la regeneración.
Introducción
La actividad física y las intervenciones de ejercicio se utilizan para promover la salud general, prevenir y retrasar el desarrollo de la enfermedad crónica y los efectos de combate del envejecimiento (1), (2). Además, se han utilizado varias intervenciones de ejercicio para mejorar la función motora después de la lesión de la médula espinal tanto en modelos animales como en práctica clínica (3)–(6). Otras enfermedades neurológicas donde se ha demostrado que el ejercicio es efectivo incluyen la enfermedad de Parkinson (7)Enfermedad de Alzheimer (8) y neuropatía diabética (9) entre muchos otros. El impacto del ejercicio en la regeneración del nervio periférico ha atraído relativamente poca atención (10).
A diferencia de la lesión del sistema nervioso central, cuando los axones periféricos se lesionan, hay una respuesta regenerativa robusta que resulta en buenos resultados funcionales con lesiones nerviosas distales. Sin embargo, las lesiones nerviosas proximales dan como resultado una recuperación deficiente en parte debido a la lenta tasa de regeneración y los cambios de denervación crónica que tienen lugar en los segmentos distales del nervio y en el músculo objetivo (11). Las estrategias que mejoran el crecimiento axonal tendrían un efecto beneficioso en la regeneración del nervio periférico.
Dado que se ha demostrado que el ejercicio mejora el crecimiento de neuritas en las neuronas ganglionares de la raíz dorsal, agudamente aisladas de los animales ejercitados, (12) y que este efecto dependía del factor neurotrófico, examinamos el efecto del ejercicio sobre la regeneración del nervio periférico utilizando una batería integral de herramientas de resultados y medimos los niveles de factores neurotróficos derivados del músculo. Utilizamos un modelo mediano de reparación nerviosa de regeneración nerviosa periférica. En este modelo, el nervio mediano se transecta y se repara en la parte superior del brazo, mientras que el nervio cubital se reseca por completo evitando la contribución del nervio cubital a la función de empuñadura. Este modelo muestra una mejor correlación lineal entre las evaluaciones funcionales (resistencia a la empuñadura y electrofisiología) y el número de axones que se regeneran en el nervio mediano. Usando este modelo, mostramos que el ejercicio diario de la cinta de correr ofrece una recuperación funcional más rápida y una correlación cercana con mayores niveles de factores neurotróficos en los músculos, sueros y nervios distales.
Materiales y métodos
Animales
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en condiciones estériles y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Se utilizaron ratones de tipo salvaje macho adulto en un fondo C57BL/6J, comprados en Jackson Laboratories. Los animales tenían 6-8 semanas de edad y pesaban entre 20∼30 gramos. Los animales fueron asignados al azar a tres grupos: grupo de control (CON), reparación nerviosa sin grupo de ejercicio (sin EX) y reparación nerviosa con grupo de ejercicio (EX). Cada grupo consistía en 8 animales.
Modelo de reparación de nervios medios
Todas las cirugías se realizaron bajo anestesia de inhalación profunda con isoflurano en condiciones asépticas. Brevemente, los nervios medianos y cubital se expusieron en la extremidad anterior superior en animales anestesiados. El nervio mediano se reparó suturando inmediatamente ambos extremos con material de sutura 10-0. El nervio cubital se ató con seda 8-0 y se desvió al músculo bíceps para evitar la regeneración. El sitio quirúrgico se cerró con grapas estériles y los animales fueron devueltos a viviendas regulares con analgésicos adecuados. Al día siguiente después de la cirugía, la adecuación de la transección del nervio mediano se confirmó con estudios de conducción nerviosa en los que se estimuló el nervio mediano por encima del sitio de reparación y el potencial de acción motora compuesta (CMAP) se registró en los músculos de la mano bajo anestesia por inhalación. A lo largo del estudio, los animales fueron monitoreados para el desarrollo de la autotomía.
Programa de ejecución de cinta de correr aerobic de baja intensidad
Todos los ratones se colocaron en la cinta de correr durante 30 minutos todos los días durante una semana antes de la cirugía para aclimatarse a la máquina para la cinta de correr. Después de la operación, todos los ratones tuvieron tres días de descanso y el programa de ejercicios comenzó el día 4 después de la reparación quirúrgica. El programa de ejercicios consistió en 60 minutos de carrera continua a una velocidad de 10 m/min con un calentamiento de 5 minutos y 5 minutos de enfriamiento (a una velocidad de 6 m/min) sin pendiente. Esto se realizó 5 días a la semana durante seis semanas como se describió anteriormente. (10). Los ratones sometidos a la transección del nervio mediano pudieron funcionar a 10 m/min durante 1 h, comenzando continuamente tres días después de la cirugía, a pesar de la pérdida de resistencia a la agarre de la extremidad anterior unilateral. Los ratones en la reparación nerviosa sin grupo de ejercicios se mantuvieron en sus jaulas y no recibieron ejercicio en la cinta de correr. Los ratones en el grupo de control permanecieron enjaulados durante seis semanas después de la cirugía simulada donde se abrió la piel y se expusieron los nervios medianos y cubital pero no se transeccionaron. Estos ratones no recibieron entrenamiento en cinta de correr.
Mediciones funcionales de la potencia muscular
Para evaluar la recuperación funcional, las pruebas de resistencia al agarre se llevaron a cabo una vez por semana desde la cirugía hasta el final del experimento. La prueba de resistencia al agarre se realizó utilizando el dispositivo de medición de la fuerza Chatillon (Ametek, Largo, FL). El mouse estaba sostenido por la cola y se le permitió agarrar la barra del dispositivo. Cuando el experimentador tiró de la cola en un ángulo de 45 grados, se registró la fuerza máxima generada. Esta medida se realizó 3 veces para cada animal y se registró la puntuación promedio.
La recuperación funcional también se evaluó mediante la prueba de retención de agarre de cables una vez por semana, comenzando al inicio antes de la cirugía hasta el final del experimento. En este ensayo, cada mouse se colocó en la parte superior de la cuadrícula de alambre y se permitió acomodar a este entorno durante 3 a 5 segundos antes de que la cuadrícula se invirtiera y se mantuviera aproximadamente a 30 cm de altura desde el banco. Cada uno de estos períodos de retención comenzó con las cuatro patas del mouse agarrando la cuadrícula de alambre. El tiempo de retención de la red de alambre se define como la cantidad de tiempo que toma el mouse para caer desde la pantalla invertida y se midió visualmente con un cronómetro. En cada sesión, el procedimiento se repitió tres veces con aproximadamente 5 minutos o más entre cada evaluación del tiempo de retención.
Estudios de conducción nerviosa evocada
Los estudios de conducción nerviosa evocada se realizaron en el nervio mediano utilizando el estándar de técnicas para nuestro laboratorio. Después de que los animales fueron anestesiados con isoflurano, se colocaron electrodos de grabación sobre los músculos inervados medianos en el antebrazo ventral. El nervio mediano se estimuló proximal a la lesión en la tuberosidad deltoidea con un electrodo de aguja subdérmica bipolar (CareFusion, Middleton, WI) y la grabación se llevó a cabo con Labab (AD Instruments, Colorado Springs, Co).
Morfometría nerviosa
Después de 6 semanas de ejercicio en la cinta de correr, los animales fueron anestesiados con isoflurano y decapitados. Para la evaluación morfológica, un segmento de 2 mm del nervio mediano a 3–5 mm distal al sitio de corte y reparación se extirpó rápidamente, se fijó en una solución de paraformaldehído al 4% y glutaraldehído del 3% durante dos días, y luego se transfirió al tampón fosfato de sorensen (0.1M) para el procesamiento adicional como se describió anteriormente como se describió anteriormente descrito anteriormente descrito anteriormente descrito anteriormente descrito anteriormente descrito anteriormente descrito anteriormente descrito anteriormente descrito como descrito anteriormente descrito como descrito anteriormente se describió anteriormente. (13). Brevemente, los nervios se fijaron en tetroxido de osmio, incrustados en plástico, seccionado a 1 µM usando un microtomo ultracut E (Tecnologías Reichert, DePew, NJ) y se tiñeron con azul de toluidina (1% de azul toluidina en tetrelaborado de sodio al 1%). Las imágenes digitales del nervio mediano se tomaron utilizando un método de muestreo imparcial de regiones no superpuestas de toda la sección transversal del nervio mediano. El número total de axones mielinizados por sección transversal de cada nervio regenerado se cuantificó utilizando el software Image J. Además, se calculó la relación G, que se define como la relación de diámetro del axón y el diámetro total de la fibra nerviosa. Para cada muestra, se midieron al menos 200 axones mielinizados y el promedio se contó como N = 1.
Inmunohistoquímica
Los músculos flexores extrínsecos del antebrazo inervados por el nervio mediano se cosecharon al final del estudio, se estiraron en una pequeña pieza de cartón con alfileres, fijados en paraformaldehído al 4% y luego se congelaron. El tejido incrustado en OCT se seccionó con un criostato (Microm HM 550) en secciones de 10 µm. Los portaobjetos se tiñeron bloqueando en 5% BSA/PBS luego se incubaron durante la noche con anticuerpo primario contra laminina-γ1 (número de catálogo: MAB1920, Chemicon, Billerica, MA) en BSA/PBS al 1% a 4 ° C. Los portaobjetos se lavaron 3 veces durante 5 minutos con BSA/PBS al 1%, incubados durante 90 minutos a temperatura ambiente con anticuerpo secundario apropiado (anticuerpo de IgG anti-ratón de fluoresceína, número de IgG, número de catálogo FL-200000, laboratorios vectoriales, Burlingame, CA), lavado nuevamente 3 veces durante 5 minutos con 1% BSA/PBS, y luego con medios de montaje duro con DAPITER (CATALIGO, CATALIGO: CATALIGO: CATALIGO: CATALET: CATALIG Laboratorios, Burlingame, CA). Las imágenes inmunofluorescentes se tomaron con un microscopio Eclipse i80 (Nikon) con un aumento de 10 × para el análisis de medición de miofibras. El tamaño de la miofibra se determinó midiendo el diámetro mínimo de los hurones de 700–1000 fibras para 3–5 ratones por grupo de tratamiento utilizando el software Nikon NS Elements 2.0. El promedio de cada animal se contó como n = 1. Las imágenes representativas del tamaño de la miofibra se tomaron a 20 × aumento.
Mediciones de proteínas de factor neurotrófico (GDNF, BDNF, IGF-1)
La sangre total se recogió del corazón expuesto en el momento de la decapitación de animales profundamente anestesiados y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, el suero se obtuvo centrifugando la sangre total a 2000 rpm a 4 ° C durante 15 minutos y se almacenó a -80 ° C hasta el análisis. Se usó el regente de extracción de proteína tisular (T-PER) para la extracción de proteínas del nervio mediano distal y el músculo extremo del nervio mediano. El inhibidor de la proteasa (Thermo Scientific Halt Inhibitor de la proteasa Cóctel, sin EDTA) se añadió al reactivo T-Per justo antes de su uso. Se añadieron veinte ml de reactivo T-per por 1 gramo de tejido y los tejidos se homogeneizaron individualmente. Las muestras se centrifugaron a 10,000 × g durante 5 minutos a los restos celulares y de tejido. Supernatant was collected and protein levels of glial derived neurotrophic factor (GDNF), brain derived neurotrophic factor (BDNF) and insulin-like growth factor-1 (IGF-1), were measured using ELISA according to manufacturer’s protocols (Catalogue numbers: GDNF-G7620 and BDNF-G7610, Promega, Madison, WI and catalogue number: AB100695 Kit Elisa de ratón IGF-1, ABCAM, Cambridge, MA).
