Resumen
Este estudio investigó los efectos de la ingravidez simulada a largo plazo en la morfología hepática, las enzimas, el glucógeno y las proteínas relacionadas con la apoptosis mediante el uso del modelo de suspensión de cola de rata de dos meses (TS) y la mejora de la lesión hepática mediante suspensión de la cola de rata con modelo de entrenamiento de resistencia (TS & RT). Microscópicamente, los hígados de las ratas TS mostraron degeneración granular masiva, inflamación crónica y fibrosis portal. La hinchazón del retículo mitocondrial y endoplásmico y la pérdida de la integridad de la membrana se observaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Los cambios morfológicos similares, pero más suaves, se observaron en los hígados de ratas TS y RT. El análisis de bioquímica sérica reveló que los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) fueron significativamente más altos (P <0.05) en ratas TS que en los controles. Los niveles de ALT y AST en ratas TS y RT fueron ligeramente más bajos que en las ratas RT, pero fueron insignificantemente más altos que en los controles. Sin embargo, las ratas TS y TS y RT tenían niveles significativamente más bajos (P <0.05) de glucosa sérica y glucógeno hepático que en los controles. La inmunohistoquímica demostró que las expresiones de Bax, Bcl-2 y caspasa-3 activa fueron mayores en ratas TS que en ratas TS y RT y control. La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR en tiempo real) mostró que las ratas TS tenían niveles de ARNm más altos (P <0.05) de la proteína 78 regulada por glucosa (GRP78) y la transcripción de caspasa-12 que en ratas control; Mientras que las expresiones de ARNm de la proteína homóloga C/EBP (CHOP) y la quinasa N-terminal C-Jun (JNK) fueron ligeramente más altas en las ratas TS. Las ratas TS y RT no mostraron diferencias significativas de los ARNm superiores a 4 en comparación con el grupo de control. Nuestros resultados demostraron que la ingravidez a largo plazo causó lesiones hepáticas y puede desencadenar la apoptosis hepática. Entrenamiento de resistencia ligeramente mejorado daños hepáticos.
Introducción
Los impactos físicos y psicosociales en los astronautas durante el vuelo espacial siempre son una gran preocupación y también en gran medida desconocidas, aunque los humanos han explorado con éxito el espacio durante más de 50 años (1–3). Para comprender los riesgos del vuelo espacial, los modelos de ingravidez simulados por tierra han desempeñado un papel importante y tienen algunas ventajas sobre el experimento de vuelos espaciales (4). El modelo de suspensión de cola de rata (TS) se ha utilizado para estudiar los efectos de la ingravidez en el cuerpo humano y los órganos mediante el uso de la condición de ingravidez simulada durante muchos años (5–7). Este modelo ha demostrado que la ingravidez a largo plazo puede causar daños sistémicos de órganos, como pérdida de hueso, fractura ósea, pérdida y atrofia muscular, trastornos cardiovasculares y disfunción renal ((8–13). La ingravidez simulada puede disminuir el glucógeno hepático y aumentar la gluconeogénesis hepática (14, 15). El vuelo espacial puede causar efectos significativos en el glucógeno hepático, los lípidos y las enzimas en ratas (16). Los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) aumentaron después de la ingravidez simulada de 7 días (17). Estos datos sugirieron fuertemente que la ingravidez podría causar lesiones hepáticas.
Se ha informado que el entrenamiento de resistencia (RT) es capaz de proteger el sistema musculoesquelético en varios modelos animales. La RT puede mejorar la fuerza ósea mediante la contracción muscular y estimular la formación de huesos (18). Las vibraciones evitan la pérdida de fuerza en el fémur y la tibia de ratas adultas (19). Sin embargo, se desconoce si la RT puede proteger la lesión hepática causada por la ingravidez a largo plazo. Por lo tanto, este estudio fue evaluar la lesión hepática asociada con la ingravidez a largo plazo por el modelo TS, la mejora de la lesión hepática por el modelo TS y RT y el posible mecanismo molecular.
Materiales y métodos
TS y TS & RT
Se compraron ratas wistar machos de ocho semanas de edad (aproximadamente 290 g) en el Centro de Animales Experimental, Academia de Medicina Militar (Número de certificado: 038695). Las ratas se enjaean por separado en una habitación mantenida a 23 ° C y ciclos de luz/oscuridad controlados (12 h/12 h). Las ratas fueron asignadas aleatoriamente a tres grupos de 10 ratas cada uno de los siguientes: grupo de control (sin suspensión de cola durante 8 semanas), grupo TS y grupo TS & RT. Los tratamientos de ratas en cada grupo se han descrito anteriormente (20). Brevemente, las ratas que se encuentran en la extremidad posterior en el grupo TS se suspendieron usando un dispositivo de fundición de cola que contiene un aparato de estímulo eléctrico, una lámpara indicadora y un tubo ortostático especial. Las ratas en TS y RT se vieron obligadas a hacer ejercicio mediante pulso eléctrico administrado por un dispositivo que tiene un electrodo que se adhiere en la cola de la rata y otro electrodo que se conecta a una placa de aluminio debajo de los pies de la rata. Las ratas fueron entrenadas para levantar el cilindro interno usando su hombro a una altura preestablecida para apagar la lámpara indicadora. De lo contrario, el dispositivo entregaría un pulso eléctrico de 10 voltajes durante 0.3 s para estimular la rata al ejercicio. Las ratas desarrollaron un reflejo de condición para levantar el cilindro de otros 2 s siguiendo una señal ligera y ligera. Las ratas realizaron cuatro veces (12 repeticiones para cada vez) al 65% al 75% de 1 RM (el peso máximo levantado por una rata usando el aparato de capacitación en cuclillas). Entre cada dos veces, a las ratas se les permitió descansar en posición de pie dentro del aparato durante 90 s. El RT se realizó cinco días por semana durante 8 semanas. Antes de la aplicación de la suspensión de la cola, los animales del grupo TS y RT se aclimataron a RT utilizando el dispositivo anterior para levantar 50 g más su propio peso corporal.
Colecciones de muestras
Después de la suspensión de la cola de dos meses, las ratas se anestesiaron con pentobarbital de sodio al 1% (45 mg/kg). Se recogieron muestras de sangre de la aorta abdominal. Las muestras de suero se separaron para evaluar los niveles de glucosa ALT, AST y suero. Después de que los animales fueron sacrificados, los hígados fueron retirados rápidamente y pesaron. Los hígados frescos (aproximadamente 20 g) se recogieron y almacenaron a -80 ° C para un estudio bioquímico. Se recogió una pieza de hígado de cada rata y se fijó en solución de glutaraldehído-polioximetileno al 2.5% (v/v) para estudios morfológicos e inmunohistoquímicos. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por las Reglas del Comité de Cuidado de Animales del Centro de Investigación y Entrenamiento de Astronautas de China (ID: 26784) y el Cuidado Institucional de Animales y Comité de la Universidad Agrícola de China (ID: 15883).
Exámenes histopatológicos
Los hígados completamente fijos se incrustaron en bloques de parafina, se seccionaron a 4 μm y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) por técnicas de rutina. Se usaron secciones adicionales no tintas para la inmunohistoquímica, la tinción de tricromo de Mallory, Red Sirius y ácido periódico (PAS). La morfología hepática se evaluó con un microscopio de luz.
Microscopía electrónica de transmisión
Los tejidos restantes se fijaron posteriormente en tetroxido de osmio al 1%, incrustados en Epon 812, cortados en secciones de 60-70 nm, teñidos con acetato de uranilo y citrato de plomo, y examinado mediante la microscopía electrónica de transmisión (TEM) (JEOL1230, Jeol, Tokio, Japón) según el método descrito por Ye Ding ((Ding ((TEM)21).
Ensayos inmunohistoquímicos
Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio fueron Bax (1: 200 dilución; Boster Co La tinción inmunohistoquímica se realizó de acuerdo con las instrucciones del kit (ZSGB-BIO, Beijing, China, SP-9001). Brevemente, las secciones de tejidos se desparafinizaron con xileno y se rehidrataron en la serie de etanol. La actividad de peroxidasa endógena se bloqueó por incubar secciones en 0.3% h2O2 en metanol durante 30 minutos. Después de aplicar tampón de bloqueo (Zymed Laboratories, Inc. San Diego, EE. UU.), Las secciones de tejido se incubaron con anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche. Los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo secundario biotinilado anti-conejo (Beijing Zhong Shan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. Beijing, China) durante 30 minutos. Las secciones se incubaron luego con 3, 3-diaminobencidina tetrahidrocloruro (DAB) (Beijing Zhong Shan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. Beijing, China) durante 10 minutos y contrarrestado con la hematoxilina de Mayer.
Las señales positivas para las proteínas Bax, Bcl-2 y Caspasa-3 activas se representaron por una masa granular marrón o amarilla y se midieron utilizando el sistema de análisis de imágenes Motic Med 6.0 CMIA (Motic China Group Co., Ltd.). Se seleccionaron y analizaron un total de 150 campos por rata (tres campos por sección, cinco secciones por rata, 400 × aumento para el análisis de imágenes). La intensidad de tinción positiva se calculó como la relación del área teñida con el campo total evaluado.
PCR en tiempo real
El trizol se obtuvo de Invitrogen, y los kits de transcripción de ARN, DEPC, 2X TAP, mezcla de PCR y marcador de ADN se obtuvieron de Applied Biosystems. Los pares de cebadores utilizados para analizar el ADNc se enumeran en Tabla 1 (22–24). La PCR en tiempo real se realizó como se describió anteriormente (21). Para la PCR en tiempo real, se usaron 10 muestras en cada grupo, y cada muestra se ejecutó por triplicado.
Análisis cuantitativo y análisis estadístico
Los datos experimentales se analizaron utilizando un ANOVA unidireccional con el programa estadístico SAS, y se realizaron múltiples comparaciones entre los grupos utilizando el método SNK (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.). Los resultados se expresan como medias y desviaciones estándar (media ± DE). P <0.05 se consideró estadísticamente significativo. P <0.05 se indica por "*" y "#", mientras que P <0.01 se indica por "**" y "##".
Resultados
Pesas de cuerpo e hígado
Como se presenta en Tabla 2se observó una reducción significativa de los pesos corporales en el grupo TS y TS & RT (P <0.01) y los pesos hepáticos en tres grupos no mostraron diferencias significativas. Además, las relaciones hígado a peso corporal de ratas en el grupo TS y TS y RT fueron significativamente mayores que en el grupo control (P <0.05). Sin embargo, no hubo diferencias significativas de las relaciones hepáticas a peso corporal entre el grupo TS y el grupo TS y RT.
Niveles de ALT y AST en suero
Los niveles de ALT y AST en suero se presentaron en Fig. 1A. Ambas enzimas en ratas TS se elevaron significativamente en comparación con el grupo de control (P <0.05). Sin embargo, los niveles de ALT y AST en el grupo TS y RT estaban entre las ratas TS y TS y RT sin diferencias de significancia.
R: niveles de ALT y AST en suero: los niveles ALT y AST en el grupo TS aumentaron significativamente en comparación con el grupo de control, y los niveles de ALT y AST en el grupo TS y RT aumentaron en comparación con el grupo control pero se redujeron en comparación con el grupo TS; Sin embargo, estas diferencias no fueron significativas. B: Niveles de glucosa sérico: los niveles de glucosa sérico en los grupos TS y TS y RT disminuyeron significativamente en comparación con el grupo de control (los datos se expresan como la media ± SD. * P <0.05, significativamente diferente del grupo de control).
Niveles de glucosa sérica y glucógeno hepático
Los niveles de glucosa sérica en el grupo TS y TS y RT disminuyeron significativamente en comparación con el grupo de control (P <0.05) (Fig. 1B). La tinción con PAS demostró que los hígados de las ratas control tenían una tinción citoplasmática PAS fuerte (glucógeno) en los hepatocitos alrededor de las venas centrales (Fig. 2A). Sin embargo, los hígados de las ratas TS tenían una mancha de PAS más débil. Las células positivas se ubicaron principalmente en las áreas del portal. Se observaron células PAS positivas dispersas en las áreas de venas centrales (Fig. 2B). En el grupo TS y RT, las células PAS positivas se ubicaron tanto en las áreas de los hígados de portal como central de los hígados (Fig. 2C). Un análisis semicuantitativo del glucógeno hepático por tinción con PAS (P <0.01) fue consistente con los resultados de la glucosa sérica (Fig. 2D).
