Resumen
Existe una gran demanda de una técnica novedosa que facilite la identificación rápida de múltiples polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) prevalentes en los atletas de élite. Se han realizado estudios de casos y controles y de asociación de todo el genoma (GWAS) para investigar la probabilidad de éxito de un individuo en diversos deportes, revelando varios loci putativos asociados con el estatus atlético de élite. Sin embargo, sigue siendo un desafío detectar múltiples SNP de este tipo simultáneamente con el objetivo de examinar su influencia en características específicas de la aptitud física, como la potencia muscular, la fuerza o la resistencia. El objetivo del presente estudio es desarrollar un ensayo de amplificación por PCR de 38 plex, integrado con espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS), para la identificación de 38 SNP vinculados al rendimiento deportivo de élite y evaluar sus métricas de rendimiento cuantitativas y capacidades de alto rendimiento dentro de una única reacción de 38 plex. Los SNP se eligieron en función de su alta prevalencia entre los atletas de potencia de élite, su posible influencia en la producción de potencia muscular y su idoneidad para la amplificación por PCR múltiple. El método desarrollado detectó simultáneamente los SNP objetivo en un solo tubo, utilizando una concentración mínima de ADN de 10 ng/μL y logrando una tasa total de llamadas de muestra del 93,13 %. Con más investigaciones, este nuevo protocolo, que integra la especificidad de la PCR múltiple y la sensibilidad de MALDI-TOF MS, puede ofrecer una oportunidad única para profundizar nuestra comprensión de la base genética de la aptitud física y puede tener aplicaciones prospectivas en iniciativas de investigación que exploren los factores genéticos que influyen en el rendimiento deportivo, por ejemplo, el Speed Gene Study.
Introducción
El fitness relacionado con la salud, como la resistencia cardiovascular, la fuerza muscular y la resistencia, se asocia sistemáticamente con un riesgo reducido de enfermedades crónicas y una mejor salud y bienestar general. La potencia muscular se clasifica como un componente de aptitud física relacionado con las habilidades, pero también es crucial para la salud humana, la prevención de lesiones y la longevidad (1,2). La disminución de la potencia muscular relacionada con la edad ocurre a un ritmo más del doble de la pérdida de fuerza relacionada con la edad (3). El entrenamiento de potencia constante puede retardar la pérdida de potencia muscular, prevenir la sarcopenia y preservar las propiedades de las fibras musculares; sin embargo, la producción de potencia muscular está influenciada en gran medida por factores hereditarios (4). En estudios con gemelos, la potencia muscular exhibe una heredabilidad estimada más alta que la fuerza muscular y la resistencia cardiovascular (5); lo que sugiere que puede ser útil investigar la influencia de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) específicos sobre la potencia muscular.
Se han realizado numerosos estudios cualitativos para descubrir los SNP asociados con la producción de potencia muscular, centrándose en el estado atlético de potencia de élite, comparando las frecuencias de SNP entre cohortes de velocistas de élite, atletas de resistencia y controles. Investigaciones de este tipo han identificado SNP ubicados en múltiples genes, incluidos ACTN3 (6), MSTN (7), IGF1 (8), CNFR (9), NOS3 (10), y GALNTL6 (11). Aunque los estudios cuantitativos ofrecen mayor valor y menos sesgo, son menos comunes en este campo de investigación (12,13), debido a la complejidad de la recopilación de datos y la necesidad de muestras de gran tamaño para detectar efectos genéticos sutiles de SNP específicos en características fisiológicas, como la producción de potencia muscular (14,15) o consumo máximo de oxígeno (16,17). Además, la mayoría de los estudios cuantitativos en el campo carecen de análisis genéticos de alto rendimiento para la identificación de SNP (18), se han centrado en solo uno o dos SNP debido a las limitaciones de las metodologías genéticas convencionales, como RFLP y PCR cuantitativa (q-PCR), que requieren mucho tiempo, trabajo y costos, lo que dificulta la detección simultánea de múltiples objetivos de SNP. La tecnología de secuenciación de próxima generación permite una identificación de alto rendimiento; sin embargo, dichos métodos requieren un proceso complejo de preparación de la biblioteca e interpretación de los resultados. Por lo tanto, es crucial desarrollar e introducir en el campo un método de identificación simple de alto rendimiento para la detección rápida y simultánea de múltiples SNP que influyen en características específicas de la aptitud física, como la fuerza, la potencia o la resistencia muscular.
El presente estudio tiene como objetivo desarrollar un ensayo de amplificación basado en PCR multiplex de un solo tubo, integrado con MALDI-TOF MS, para la detección de los siguientes treinta y ocho SNP: rs10186876, rs11091046, rs1137070, rs11549465, rs12778366, rs13135092, rs143384, rs17602729, rs1801131, rs1801282, rs1805065, rs1805086, rs1815739, rs2070744, rs2275998, rs2290463, rs2439823, rs2854464, rs2920503, rs303760, rs3213537, rs3758391, rs4074992, rs41274853, rs4253778, rs4734621, rs55743914, rs558129, rs56068671, rs671, rs680, rs6905419, rs699, rs699785, rs7247312, rs7832552, rs8111989 y rs9320823, y evaluar su rendimiento mediante el análisis de métricas cuantitativas como tasas de llamadas y tasas de error dentro de una sola reacción. Cada uno de estos SNP exhibió una alta prevalencia entre los atletas de élite orientados a la potencia (6–11). Algunos de estos SNP también pueden afectar las propiedades mecánicas de los músculos en la población general, como se muestra en el Speed Gene Study, una iniciativa de investigación interdisciplinaria con el objetivo de determinar cuantitativamente qué parte de la variabilidad de la potencia muscular de un individuo se puede atribuir a ciertos polimorfismos genéticos (19). El presente estudio implicó el desarrollo de un panel personalizado de SNP que previamente se habían reportado como comunes entre los atletas de élite orientados a la potencia, y que pueden influir en rasgos de rendimiento medibles, por ejemplo, producción de potencia y torsión, en la población general. Estos SNP se seleccionaron en función de su alta frecuencia en estudios de atletas de élite, su posible influencia en la fuerza muscular y la producción de potencia, y su idoneidad del cebador para la amplificación por PCR múltiple dentro de la capacidad máxima de prueba de MALDI-TOF MS. Esta técnica facilita la amplificación paralela de 38 secuencias de ADN específicas en una sola reacción, dando como resultado la creación de amplicones. Posteriormente, estos amplicones sirven como plantillas para una reacción de extensión de un solo nucleótido, y los productos finales con masas moleculares definidas se analizan mediante MALDI-TOF MS (20). Esta tecnología distintiva facilita la detección y el análisis de genes específicos según el peso molecular y puede ofrecer numerosos beneficios en aplicaciones relacionadas con los deportes en comparación con los métodos tradicionales de genotipado, que se destacarán y discutirán en este estudio.
Métodos
Todos los procedimientos de investigación en humanos seguidos estuvieron de acuerdo con los estándares éticos del comité responsable de la experimentación en humanos (institucional y nacional) y con la Declaración de Helsinki de 1975, revisada en 2013. Todos los métodos utilizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación en Humanos de la Universidad Mahidol (ID de solicitud de ética: MU-CIRB 2024/417.2410) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y leyes pertinentes que se aplican en Tailandia y con la Declaración de Helsinki de 1975, revisado en 1983. No se utilizaron animales en esta investigación. El protocolo descrito en este artículo revisado por pares, incluido el aislamiento de ADN y el diseño del cebador, está depositado en protocolos.io (DOI: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.eq2ly4b5elx9/v1) y se incluye para fines de impresión como información de respaldo del archivo S1.
Aislamiento de ADN genómico.
En este estudio se incluyeron cuarenta y seis tailandeses varones sanos (durante ≥3 generaciones) con una edad media de 25,34 años y un índice de masa corporal (IMC) de 23 kg/m² para garantizar tanto la composición corporal como la homogeneidad genética. La sangre (200 µl) se recogió mediante lancetas con resorte y tubos capilares de vidrio y se almacenó en tubos con EDTA a 5 °C.oh durante un máximo de 3 días antes de la extracción de ADN. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la extracción de sangre. El reclutamiento de participantes se llevó a cabo de marzo a septiembre de 2025. El ADN se aisló de los glóbulos blancos utilizando métodos de separación de ADN basados en perlas como lo sugiere (18). Brevemente, el proceso implicó agregar perlas magnéticas a la muestra, donde el ADN se une a las perlas. Luego, las perlas se separaron de la muestra mediante un campo magnético, lo que permitió la eliminación de contaminantes y el aislamiento de ADN puro. Usando este método para las 46 muestras de ADN incluidas en este estudio generamos rendimientos de hasta 160 ng/μl. el sbeadex MT Se utilizó un kit de ADN en sangre (Biosearch Technologies, Alemania) para la extracción de ADN siguiendo el protocolo del fabricante, lo que produjo ADN genómico de alta pureza adecuado para pruebas de especificidad de cebadores y experimentos de desarrollo de métodos. La calidad del ADN extraído se evaluó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, Estados Unidos). Para experimentos posteriores se eligieron muestras con una relación OD260/280 que oscilaba entre 1,8 y 2,0 y una relación OD260/230 dentro del intervalo de 2,0 a 2,2.
Diseño de imprimación
El diseño del cebador incluyó la obtención de una cantidad considerable de secuencias de ADN para cada locus objetivo de la base de datos del genoma NCBI (21). Posteriormente, las secuencias de ADN se alinearon utilizando el software de alineación CLUSTAL-W (22) para identificar áreas altamente conservadas para el diseño de cebadores con el programa Assay Design 4.0 (Agena Bioscience, Inc., California, Estados Unidos). Todas las secuencias de genes objetivo se ingresaron en el programa, siguiendo las pautas del fabricante. Además, el método de diseño de cebadores siguió criterios rigurosos para reducir la formación de dímeros de cebador, bucles en horquilla y cebado no específico, garantizando así la síntesis de cebadores de excelente calidad. Además, la especificidad de los cebadores sintetizados se evaluó utilizando el software BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) para verificar la especificidad óptima de los cebadores. Sólo se eligieron cebadores que demostraran la máxima especificidad para el protocolo basado en PCR múltiple desarrollado en este estudio. Es esencial señalar aquí que las modificaciones manuales, incluidas las alteraciones de bases y los cambios en la secuencia del cebador, se llevaron a cabo cuando fue necesario para lograr uniformidad en los valores del contenido de guanina-citosina (% GC) y la temperatura de fusión (Tm) entre los cebadores múltiples, optimizando así el protocolo de amplificación por PCR. Todos los cebadores fueron sintetizados por Macrogen, Inc. en Seúl, Corea.
Se desarrollaron un total de 38 pares de cebadores de PCR múltiple para el panel de ensayo utilizando Assay Design Suite v4.0. Las longitudes oscilaron entre 142 y 88 pb, con temperaturas de fusión (Tm) que variaron entre 45,7 y 66,5 °C y porcentajes de contenido de GC que fluctuaron entre 15 y 88,2 %. Se sintetizaron treinta y ocho productos de PCR que medían entre 88 y 142 pb, para producir productos SBE no superpuestos con masas moleculares que abarcaban desde 4150,7 a 7738,1 Da, y un rango de masa molecular de 4462,9 a 8065,2 Da, todos basados en la secuencia seleccionada. Las temperaturas de fusión (Tm, °C), el contenido de guanina-citosina (%GC) de cada SNP objetivo, las masas moleculares de los cebadores de extensión y los productos SBE se muestran en los datos complementarios proporcionados en el archivo de información de respaldo. Tabla S2mientras que las secuencias de nucleótidos de los cebadores se presentan en Tabla 1 abajo.
Optimización del protocolo
El panel de ensayo personalizado de los SNP informados anteriormente relacionados con el éxito atlético en deportes relacionados con la potencia se optimizó y ajustó de acuerdo con las pautas del fabricante. Brevemente, la mezcla de reacción de PCR de 5 μL contenía 0,50 μL de tampón de PCR, 0,40 μL de MgCL20,10 μL de dNTP y 0,20 PCR Enzyme (Agena Bioscience, California, Estados Unidos), 1 μL de mezcla de cebadores que produce una concentración final de 500 nM para cada cebador directo e inverso, 2,0 μL de plantilla de ADN y 0,80 μL de agua destilada sin ADNasa. La PCR múltiple…
