Resumen
El microARN-34a (miR-34a) se asoció estrechamente con la esteatosis hepática. Sin embargo, el vínculo entre los cambios en miR-34a y la progresión de la esteatosis hepática sigue sin estar claro. En el trabajo, se seleccionaron al azar y por igual sesenta ratones en seis grupos: grupo de control normal (NC), grupo de ejercicio normal (NE), grupo de dieta alta en grasas (HFD), grupo de dieta alta en grasas más ejercicio (HFE), grupo de sobreexpresión de miR-34a (OE) y grupo de sobreexpresión de miR-34a más ejercicio (OEE). La morfología en vivo mostró que la intervención de ejercicio en cinta rodante durante 8 semanas redujo la esteatosis hepática inducida por una dieta alta en grasas en ratones. El ejercicio en cinta rodante durante 8 semanas disminuyó directamente la expresión de mir-34a en ratones en el grupo HFD, confirmado en el grupo OE. Además, el ejercicio en cinta rodante mejoró la expresión de PPARα y SIRT1, afectando así a los genes diana asociados a la esteatosis hepática, incluidos CPT1 (carnitina palmitoiltransferasa 1), CPT2 (carnitina palmitoiltransferasa 2), SLC27A1 (familia de portadores de solutos 27, miembro 1), SLC27A4 (familia de portadores de solutos 27, miembro 4), además de activar la expresión del sistema central. Sensor metabólico AMPK. Después de una intervención de ejercicio aeróbico, miR-34a se reguló negativamente, lo que afectó la expresión de genes asociados con la esteatosis hepática, y este mecanismo se confirmó en ratones con sobreexpresión de miR-34a. Este estudio contribuyó a nuestra comprensión de la patogénesis de la esteatosis hepática y puede proporcionar nuevos enfoques terapéuticos.
1. Introducción
La esteatosis hepática fue la aparición de gotas de grasa en el citoplasma de las células hepáticas cuyo desarrollo a largo plazo puede causar necrosis de hepatocitos, fibrosis hepática, esteatohepatitis que puede convertirse en cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular (1,2). En los últimos años, con la mejora del nivel de vida de las personas y la disminución del tiempo de ejercicio, la esteatosis hepática se ha convertido en un grave problema de salud pública en el mundo, que afecta al 30-40% de la población total y sigue aumentando (3). Sin embargo, el mecanismo de la esteatosis hepática fue extremadamente limitado y no ha sido determinado. Por tanto, la investigación de los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión de la esteatosis hepática era urgente para obtener enfoques terapéuticos eficaces.
El microARN (miARN) era un pequeño ARN monocatenario no codificante de aproximadamente 19 a 25 nucleótidos de longitud, que podía regular la expresión de su gen diana mediante un emparejamiento complementario inverso con la secuencia parcial de la región 3′ no traducida (3’UTR) de su gen diana (4). En muchas enfermedades, los miARN han recibido una atención cada vez mayor debido a su desequilibrio y su potencial como dianas diagnósticas y terapéuticas.5,6). Se ha informado que miR-34a, un miARN específico, muestra un alto nivel de expresión en pacientes con enfermedad hepática (7–9). Además, los estudios han informado que la inhibición de miR-34a puede aumentar los niveles de sus objetivos posteriores, incluido el receptor α activado por proliferador de peroxisomas (PPARα) y la familia de proteínas Sirtuin-Sirtuin1 (SIRT1), que estaban relacionados con la oxidación de ácidos grasos, aliviando así la esteatosis hepática (10).
Como miembro de la superfamilia de receptores nucleares, el PPARα unido al ligando forma un heterodímero con el receptor de retinoide X (RXR), y luego el heterodímero se une al elemento de respuesta PPAR de los genes diana que promueven la transcripción de sus genes posteriores relacionados con la oxidación de ácidos grasos.11). Entonces, PPARα tuvo grandes efectos en la regulación del metabolismo de los lípidos hepáticos. Los genes diana clave de PPARα que estaban involucrados en la oxidación y el transporte de ácidos grasos consistían en la familia de transportadores de solutos, incluidos SLC27A y CPT (12).
SIRT1 era un miembro esencial de la familia de proteínas Sirtuin y era una desacetilasa dependiente de NAD, estrechamente asociada con la esteatosis hepática (13). La AMP quinasa (AMPK), un conocido regulador del metabolismo energético, tuvo un papel importante en el desarrollo y progresión de enfermedades metabólicas, y SIRT1 puede activar su actividad promoviendo así su fosforilación.14). Luego, la fosforilación del gen de oxidación de los ácidos grasos β regulados positivamente por AMPK y las proteínas relacionadas con el transporte de ácidos grasos reguladas negativamente, reduce así la esteatosis hepática.15). Por lo tanto, la vía de señalización de la fosforilación de SIRT1-AMPK funciona en la regulación de la homeostasis metabólica de los lípidos y puede ser un nuevo objetivo terapéutico para la esteatosis hepática.
Los estudios han informado que el ejercicio aeróbico fue una intervención de bajo costo y bajo riesgo que puede reducir efectivamente la aparición y el desarrollo de esteatosis hepática y ha sido adoptado por la mayoría de las personas (16,17). El propósito de este estudio fue determinar si el ejercicio aeróbico puede mejorar la esteatosis hepática ajustando la vía de señal miR-34a-PPARα/SIRT1.
2. Materiales y métodos
2.1 Permiso ético
Todas las operaciones en este experimento se realizaron bajo las reglas de ética de la investigación de la Universidad de Shanxi con el número de aprobación CIRP-IACUC-(R)2019014, de acuerdo con la guía de ética animal local e internacional y con los máximos esfuerzos para minimizar el sufrimiento animal.
2.2 Animales
Se compraron sesenta ratones machos C57BL/6J de grado SPF (8 semanas de edad), con un peso de 21,4 ± 0,92 g, de Beijing Life River Laboratory Animal Technology Co. (licencia animal NO. SCXK (Beijing) 2016-0006). Después de una alimentación adaptativa durante una semana, los ratones fueron seleccionados al azar y por igual en seis grupos: grupo de control normal (NC), grupo de ejercicio normal (NE), grupo de sobreexpresión de miR-34a (OE), grupo de sobreexpresión de miR-34a más ejercicio (OEE), grupo de dieta alta en grasas (HFD, 60 % de grasa, 20 % de carbohidratos y 20 % de proteína) y grupo de dieta alta en grasas más ejercicio (HFE). Todos los ratones se alojaron en condiciones estándar de laboratorio con 12/12 ciclos de luz oscura, 20–26 °C, 40–60 % de humedad relativa y libre acceso a comida y agua. Los pesos corporales de los ratones se registraron semanalmente. Después del último ejercicio en cinta rodante, los ratones permanecieron en ayunas durante la noche, se anestesiaron por vía intraperitoneal con una dosis de 80 mg/kg de pentobarbital sódico y luego se ejecutaron. Las muestras de sangre se recogieron en un tubo que contenía EDTA y se centrifugaron a 4 °C y 3500 rpm durante 15 minutos, luego el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se almacenó a -80 °C. Los hígados se extrajeron rápidamente y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría, luego algunos de los tejidos del hígado se cortaron en el fijador y los tejidos del hígado restantes se guardaron a -80 °C. El protocolo se muestra en (Figura 1A).
Después de la alimentación adaptativa, se inyectó el vector viral adenoasociado TBG (AAV9) de sobreexpresión impulsada por el promotor TBG (Sangon Biotech, Shanghai, China) (Sangon Biotech, Shanghai, China) en la vena de la cola para promover específicamente la expresión de miR-34a en el hígado del ratón.
Después de 4 semanas de una dieta normal o alta en grasas, los ratones de los grupos NE, OEE y HFE realizaron 1 semana de ejercicio adaptativo en cinta rodante, seguido de 8 semanas de ejercicio en cinta rodante a partir de las 7 p. m. todos los días.
2.3 Ensayo de triglicéridos
Los triglicéridos (TG) se midieron a 510 nm en un espectrofotómetro (UV-6100s, Mapada, Shanghai, China) utilizando el kit y siguiendo estrictamente las instrucciones del kit.
2.4 Análisis histológico
El tejido hepático se fijó primero en formalina tamponada neutra al 10% y luego se tiñó con hematoxilina-eosina (H&E) para ver el nivel de esteatosis hepática mediante el microscopio.
2.5 PCR cuantitativa en tiempo real
El ARN total se extrajo de los hígados utilizando un kit de purificación de ARN total de animales con columna giratoria (Sangon Biotech, Shanghai, China) y se transcribió de forma inversa utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena M-MuLV (Sangon Biotech, Shanghai, China) según el protocolo del fabricante. La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se realizó en un sistema LightCycler480 (Roche, Suiza) utilizando la mezcla TB Green premix Ex Taq Ⅱ (TaKaRa, Dalian, China). La expresión del gen objetivo se calculó mediante el método 2^-△△CT. Los cebadores específicos de genes se presentaron en (Tabla 1), con control interno del GAPDH.
2.6 transferencia Western
Los tejidos del hígado se lisaron en tampón de lisis RIPA y la concentración de proteína se determinó mediante el método BCA (Beyotime, Shanghai, China). Se separaron proteínas de 40 μg mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), luego se cortaron y se transfirieron a membranas de PVDF, bloqueadas durante 1 hora con leche descremada al 5%. Después de la incubación durante la noche con anticuerpo primario (1:1000 anti-PPARα, anti-SIRT1, anti-AMPK, anti-CPT1, anti-CPT2, anti-SLC27A1, anti-SLC27A4) (Proteintech Group Inc, Wuhan, China), las membranas se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:5000) (Boster Biotech, Wuhan, China). Luego se utilizó el kit de detección ECL (Applygen Technologies Inc, Beijing, China) para la detección y se realizaron imágenes en un medidor de quimioluminiscencia (ChemiDoc XRS+, Bio-Rad, EE. UU.).
2.7 Análisis estadístico
Todos los datos se muestran como media ± DE (norte = 10). El análisis estadístico se realizó mediante el software SPSS 25.0. Se utilizó ANOVA unidireccional para comparaciones múltiples. Se utilizó una prueba t de dos colas para comparar entre dos grupos. pag< 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
3. Resultados
3.1 El ejercicio en cinta rodante alivió la esteatosis hepática en ratones
La observación morfológica del hígado se mostró en (Figura 2A). No hubo cambios obvios en el hígado de los ratones NC y NE (p >0,05), que era de color rojo fresco con una envoltura lisa y bordes claros. En el hígado de los ratones del grupo HFD era de color marrón amarillento con bordes romos, textura suave y una superficie grasosa. Después del ejercicio en cinta rodante, el estado hepático de los ratones del grupo HFE mejoró en comparación con los ratones del grupo HFD (pag <0,05). La tinción H&E del tejido hepático proporciona una evaluación inicial de si se está produciendo esteatosis en el hígado. Como se muestra en (Figura 2B), no hubo cambios significativos en el grupo NE y en los ratones NC (p >0,05), mientras que el grupo HFD mostró un aumento significativo en el número y tamaño de las gotitas de lípidos hepáticas con infiltración de células inflamatorias. Por el contrario, los ratones del grupo HFE mostraron un número reducido de gotitas de lípidos hepáticos, hepatocitos claramente alineados y una esteatosis hepática significativamente mejorada.pag< 0,05). Además, el peso del hígado (Figura 2C) y la relación entre el peso del hígado y el peso corporal (Figura 2D) de ratones del grupo HFDpagaumentaron significativamente a (1,53 ± 0,25) g (pag< 0,05) y (4,87 ± 0,53)% (pag< 0,05) de (1,00 ± 0,10) gy (3,3 ± 0,24)% en el grupo NCpagrespectivamente, pero después de la intervención con ejercicio aeróbico se rescató moderadamente a (1,23 ± 0,15) g (pag< 0,05 frente al grupo HFDpag) y (3,60 ± 0,28)% (pag< 0,05 frente al grupo HFDpag) en el grupo HFE, respectivamente. Una de las principales características de la esteatosis hepática fue el cambio significativo en los niveles de TG hepáticos, por lo que se detectaron niveles de TG hepáticos (Figura 2E). Los niveles de TG en el grupo HFD aumentaron significativamente a 67,67 ± 2,52 (mg/g de hígado) (pag< 0,05) conpagcomparó con el grupo NC (28,67 ± 2,08), pero después de la intervención con ejercicio aeróbico se restableció a 55,3 ± 4,53 (mg/g de hígado) (pag< 0,05 frente al grupo HFDpag) en el grupo HFE. Estas observaciones sugirieron que la esteatosis hepática inducida por una dieta alta en grasas puede atenuarse con el ejercicio en cinta rodante.
(A) Morfología del hígado. (B) Gotitas de lípidos hepáticos. (C) Peso del hígado. (D) La relación entre el peso del hígado y el peso corporal. (E) Niveles de TG en el hígado. Todos los datos se muestran como media ± DE. NC: grupo de control normal, NE: grupo de ejercicio normal, HFD: grupo de dieta alta en grasas y HFE: grupo de dieta alta en grasas más ejercicio. * pag< 0,05 frente a NC, y # pag< 0,05 frente a DFH.
