Resumen
La sobrecarga mecánica (OVL) resultante de la ablación de agonistas musculares, un modelo suprafisiológico de entrenamiento de resistencia, reduce la fragilidad del músculo esquelético, es decir, la caída inmediata de la fuerza máxima después de las contracciones de alargamiento, y aumenta la producción de fuerza máxima, en mdx ratones, un modelo murino de distrofia muscular de Duchene (DMD). Aquí, analizamos más a fondo estos efectos beneficiosos de OVL determinando si fueron bloqueados por la ciclosporina, un inhibidor de la vía de la calcineurina, y si también se observaron en los ratones D2-mdx, un modelo murino de DMD más grave. Encontramos que la ciclosporina no bloqueó el efecto beneficioso de la OVL de 1 mes sobre la fragilidad del músculo plantar en mdx ratones, ni limitó los aumentos en la fuerza máxima y el peso muscular (un índice de hipertrofia). La fragilidad y la fuerza máxima también mejoraron con OVL en el músculo plantar de D2-mdx ratones. Además, OVL aumentó la expresión de utrofina, γ-actina citoplasmática, MyoD y p-Akt en el D2-mdx En ratones, las proteínas desempeñan un papel importante en la fragilidad, la ganancia máxima de fuerza y el crecimiento muscular. En conclusión, OVL redujo la fragilidad y aumentó la fuerza máxima en los ejercicios suaves más utilizados. mdx modelo pero también en D2-mdx ratones, un modelo severo de DMD, más cercano a la fisiopatología humana. Además, estos efectos beneficiosos de la OVL no parecían estar relacionados con la activación de la vía de la calcineurina. Por tanto, este estudio preclínico sugiere que el entrenamiento de resistencia podría tener un beneficio potencial en la mejora de la calidad de vida de los pacientes con DMD.
Introducción
Se sabe que las contracciones de alargamiento, por ejemplo cuando el músculo ralentiza el movimiento, causan una reducción inmediata y prolongada de la función del músculo esquelético y dolor muscular retardado, incluso en músculos sanos. El músculo esquelético en modelos murinos de distrofia muscular de Duchenne (DMD), con deficiencia de distrofina, es más susceptible a la pérdida de función inducida por el alargamiento de la contracción en comparación con el músculo sano, es decir, más frágil. Más precisamente, es el músculo rápido y poco oxidativo el que es más susceptible a alargar la pérdida de función inducida por la contracción en los casos leves. mdx modelo murino DMD, en contraste con el músculo lento y más oxidativo que no es más frágil (1, 2). También se sabe que ciertas proteínas implicadas en la estructura muscular, como la utrofina, la γ-actina citoplasmática y la desmina, modulan significativamente este aumento de la fragilidad cuando la distrofina está ausente. De hecho, la sobreexpresión de utrofina (3) o γ-actina citoplasmática (4) reduce notablemente la fragilidad de mdx ratones, mientras que la ausencia de desmina la aumenta (5). La activación genética de las vías de calcineurina y Akt también puede proteger el músculo distrófico murino de la susceptibilidad a la pérdida de función inducida por la contracción, mientras que la inactivación genética de la vía mTOR la aumenta en el músculo sano.6–9). También se informó recientemente que la sobreexpresión del factor de transcripción miogénico MyoD también agrava la fragilidad muscular.10). También se sabe que estas vías regulan la especificación y el crecimiento del tipo de fibra y desempeñan un papel en las adaptaciones inducidas por el ejercicio muscular crónico en músculos sanos.11–15).
Curiosamente, el ejercicio muscular crónico puede disminuir la susceptibilidad a alargar la pérdida de función inducida por la contracción en mdx ratones. La carrera voluntaria crónica y la estimulación eléctrica de baja frecuencia, probablemente modelos animales de entrenamiento de resistencia, reducen la fragilidad en mdx músculo rápido del ratón (16–18), mientras que la inactividad física la agrava (16). Recientemente, se descubrió que la mejora voluntaria inducida por la carrera de mdx La fragilidad muscular de ratones se relacionó con la activación de la vía de la calcineurina y se asoció con cambios en el programa de genes involucrados en el fenotipo contráctil más lento de la fibra muscular.17). En este último estudio, estos efectos beneficiosos de la calcineurina fueron bloqueados mediante la administración de ciclosporina (CsA), un inhibidor de la calcineurina (17). Además, se ha demostrado que los modelos murinos de entrenamiento de resistencia también reducen la fragilidad en el mdx ratón (19, 20). De hecho, 6 sesiones de entrenamiento de resistencia (19) y sobrecarga mecánica crónica (OVL) del músculo plantar (20), un modelo suprafisiológico de entrenamiento de resistencia (21), reducen la caída de fuerza después de las contracciones alargadas en los músculos de la parte inferior de la pierna. mdx ratones (19, 20). Sin embargo, aún no se sabe si la CsA bloquea el efecto beneficioso del entrenamiento de resistencia sobre la fragilidad en el músculo distrófico. Además, dado que los modelos murinos de entrenamiento de resistencia también aumentan el peso muscular (un índice de hipertrofia) y la fuerza máxima en mdx ratones (19, 20, 22), sería interesante saber si estos aumentos máximos de fuerza y peso son bloqueados por la CsA, lo que sugiere o no un papel de la vía de la calcineurina en estos efectos beneficiosos. Se ha informado que la CsA disminuye la hipertrofia en el músculo sano OVL (23, 24), aunque no todos lo encuentran (11). Hasta donde sabemos, la contribución de la vía de la calcineurina al aumento de fuerza inducida por el entrenamiento de resistencia aún no se conoce ni en músculos sanos ni en músculos distróficos.
Los estudios anteriores que investigaron el ejercicio muscular de resistencia crónica no utilizaron un modelo de DMD murina grave, con un déficit funcional importante más cercano al del paciente con DMD. Un modelo murino desarrollado recientemente para la DMD es el D2-mdx ratones que exhiben una debilidad más marcada (fuerza máxima absoluta reducida) en comparación con mdx ratones ya que no hay hipertrofia muscular en D2-mdx ratones contrarios a mdx ratones (25–27). Por lo tanto, sería relevante determinar si un modelo de entrenamiento de resistencia también mejora la fragilidad en el D2-mdx ratones, y también la fuerza máxima absoluta.
El propósito del presente estudio fue analizar más a fondo el efecto beneficioso de la OVL sobre la fragilidad muscular y la fuerza máxima absoluta en ratones con deficiencia de distrofina, dos características distróficas funcionales importantes. En particular, queríamos saber si la administración de CsA, conocida por inhibir la vía de señalización de la calcineurina, bloqueaba el efecto beneficioso de la OVL sobre la fragilidad de mdx músculo distrófico, como lo hizo en el ejercicio de carrera crónica (17). También queríamos determinar si la CsA bloqueaba el efecto de la OVL sobre la ganancia de fuerza máxima en el músculo distrófico, ya que se ha informado que la CsA inhibe la hipertrofia al menos en el músculo sano y posiblemente la ganancia de fuerza máxima.23, 24). Otro objetivo específico importante fue determinar si OVL también ejercía estos efectos beneficiosos en un modelo murino más grave de DMD, el D2- mdx ratones.
Materiales y métodos
Aprobación ética y modelos animales.
Los animales fueron alojados en el animalario departamental, con libre acceso a agua y comida de laboratorio para roedores. La instalación para animales está libre de patógenos específicos, con un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad, y había de 3 a 5 ratones por jaula. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las legislaciones nacionales y europeas y fueron aprobados por el Ministro de Enseñanza Superior de la Investigación y la Innovación de Francia (APAFIS #21554–2019071912051421). Masculino mdx ratones (con fondo híbrido C57Bl/6 x C57Bl/10) y D2- mdx (antecedentes DBA2/J) se criaron localmente y se utilizaron entre los 3 y los 6 meses de edad.
Diseño experimental
Los ratones se dividieron aleatoriamente en diferentes grupos experimentales y de control de la misma edad. Realizamos 3 experimentos separados (Figura 1) para determinar: 1) si la administración de CsA bloqueó los efectos de OVL en el músculo plantar en mdx ratones, con la ablación del sóleo y la mayor parte de los músculos gastrocnemio lateral y medial, 2) los efectos de la OVL sobre el músculo gastrocnemio lateral en mdx ratones, con la ablación de un menor peso de los músculos agonistas, una OVL menos grave, y 3) los efectos de la OVL sobre el músculo plantar en D2-mdx ratones, un modelo murino de DMD mucho más grave en comparación con mdx ratones. En el segundo experimento, queríamos inducir una sobrecarga mecánica menor en comparación con la impuesta al músculo plantar, ya que la OVL del músculo plantar es suprafisiológica y conduce a ganancias de fuerza y masa cercanas al 100%, algo raramente visto en humanos (21, 28). Los músculos se estudiaron 1 mes después del inicio de OVL.
Diseño experimental del estudio, se realizaron 3 experimentos para determinar: 1) si la administración de CsA bloqueó los efectos de OVL sobre el músculo plantar en ratones Mdx (experimento 1), 2) los efectos de OVL sobre el músculo gastrocnemio lateral en ratones Mdx ( experimento 2), un OVL más bajo, y 3) los efectos del OVL en el músculo plantar en ratones D2-mdx, un modelo de DMD murina más grave en comparación con los ratones mdx. OVL: sobrecarga mecánica. CsA: ciclosporina A. Mdx+OVL: ratones Mdx sobrecargados mecánicamente. Mdx+OVL+CsA: ratones Mdx sobrecargados mecánicamente que recibieron CsA. Mdx: músculo Mdx no sobrecargado. D2-mdx+OVL: ratones D2-mdx sobrecargados mecánicamente. D2-mdx: músculo D2-mdx no sobrecargado.
Sobrecarga mecánica
Para la sobrecarga mecánica (OVL) en los 3 experimentos, se anestesiaron ratones distróficos con isoflurano. Los músculos plantares (Experimentos 1 y 3) de ambas piernas se sobrecargaron mecánicamente (ratones Mdx+OVL, Mdx+OVL+CsA y D2-mdx+OVL) durante 1 mes mediante la extirpación quirúrgica de los músculos sóleo, así como de una porción importante de los músculos gastrocnemios lateral y medial como se describe (20, 22) (Figura 1). Los músculos gastrocnemios laterales (Experimento 2) de ambas piernas se sobrecargaron mecánicamente (Mdx+OVL) durante 1 mes mediante la extirpación quirúrgica del sóleo, los músculos plantares y una porción importante de los músculos gastrocnemios mediales (Figura 1). Los músculos se midieron y recolectaron 1 mes después del inicio de OVL.
Tratamiento con ciclosporina A (CsA)
En el experimento 1, los ratones fueron tratados todos los días durante 1 mes con el inhibidor de la vía de la calcineurina ciclosporina A, CsA (25 mg/kg, ip, diariamente) (ratones Mdx+OVL+CsA)(17, 23, 24) o solución salina (ratones Mdx+OVL y Mdx) (Figura 1), el día después de la ablación muscular.
Debilidad y fragilidad muscular.
En los 3 experimentos, la fuerza máxima y la fragilidad (susceptibilidad a la pérdida funcional inducida por la contracción) se evaluaron midiendo la in situ contracción muscular en respuesta a la estimulación nerviosa, como se describió anteriormente (20). Los ratones se anestesiaron con pentobarbital (60 mg/kg, ip). La temperatura corporal se mantuvo a 37°C utilizando calor radiante. La rodilla y el pie se fijaron con alfileres y abrazaderas y el tendón distal del músculo se fijó a un brazo de palanca de un sistema servomotor (305B, palanca de modo dual, Aurora Scientific) utilizando una ligadura de seda. El nervio ciático fue aplastado proximalmente y estimulado distalmente mediante un electrodo de plata bipolar utilizando pulsos de onda cuadrada supramáximos de 0,1 ms de duración. Medimos la fuerza máxima absoluta que se generó durante las contracciones isométricas en respuesta a la estimulación eléctrica (frecuencia de 75 a 150 Hz, tren de estimulación de 500 ms). La fuerza máxima absoluta se determinó en L0 (longitud a la que se obtuvo la tensión máxima durante el tétanos). L0 se midió con un calibrador (no se incluyó la longitud del tendón distal). La capacidad de generar rápidamente fuerza muscular también se evaluó en el Experimento 1. La tasa de desarrollo de fuerza (RFD) (g/s) se midió cuando la fuerza aumentó del 0 al 25 % (RFD0-25 %), del 25 % al 50 %. (RFD25-50%) y 50% a 75% (RFD50-75%) de P0 porque los mecanismos responsables de RFD varían con el tiempo (29).
La fragilidad, es decir, la susceptibilidad a la pérdida funcional inducida por las contracciones en ratones, se estimó a partir de la caída inmediata de la fuerza resultante del alargamiento de las contracciones. El nervio ciático fue estimulado durante 700 ms (frecuencia de 150 Hz). Se inició una contracción isométrica máxima del músculo durante los primeros 500 ms. Luego, se impuso un alargamiento muscular (10% L0) a una velocidad de 5,5 mm/s durante los últimos 200 ms. Todas las contracciones isométricas se realizaron con una longitud inicial L0. Se realizaron nueve contracciones de alargamiento de los músculos plantares en ratones, cada una separada por un descanso de 60 s…
