Resumen
El ejercicio de resistencia regular induce la hipertrofia del músculo esquelético y la mejora del control glucémico en pacientes con diabetes tipo 2. La administración de deshidroepiandroterona (DHEA), un precursor de hormona esteroide sexual, aumenta la síntesis de 5α-dihidrotestosterona (DHT) y se asocia con mejoras en el nivel de glucosa en sangre en ayunas y la hipertrofia muscular esquelética. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar si el aumento en los niveles de DHT muscular, inducidos por el ejercicio de resistencia crónica, puede contribuir a la hipertrofia del músculo esquelético y la mejora concomitante del metabolismo de la glucosa muscular en ratas diabéticas tipo 2. Las ratas diabéticas tipo 2 masculinas de 20 semanas de edad (OLETF) se dividieron aleatoriamente en 3 grupos: control sedentario, entrenamiento de resistencia (3 veces a la semana en días alternativos durante 8 semanas) o entrenamiento de resistencia con infusión continua de un inhibidor de 5α-reductasa (n = 8 cada grupo). Se utilizaron ratas de Tokushima Otsuka (Leto) (n = 8) de larga duración y de larga duración. Los resultados indicaron que las ratas OLETF mostraron una disminución significativa en la DHEA muscular, la testosterona libre, los niveles de DHT y la expresión de proteínas de enzimas esteroidogénicas, con pérdida de masa del músculo esquelético e hiperglucemia, en comparación con la de las ratas Leto. Sin embargo, el entrenamiento de resistencia de 8 semanas en ratas OLETF aumentó significativamente los niveles de hormonas esteroides sexuales musculares y la expresión de proteínas de enzimas esteroidogénicas con un aumento concomitante en la masa del músculo esquelético, el nivel de glucosa en ayunas mejorado y el índice de sensibilidad a la insulina. Además, el entrenamiento de resistencia aceleró la translocación del transportador de glucosa-4 (GLUT-4) y la proteína quinasa B y la fosforilación de C-λ. La administración del inhibidor de la 5α-reductasa en ratas OLETF capacitadas en resistencia dio como resultado la supresión de los efectos inducidos por el ejercicio sobre la masa del músculo esquelético, el nivel de glucosa en ayunas, el índice de sensibilidad a la insulina y la señalización GLUT-4, con una disminución en los niveles de DHT muscular. Estos hallazgos sugieren que la elevación inducida por el entrenamiento de resistencia de los niveles de DHT muscular puede contribuir a la mejora de la hiperglucemia e hipertrofia del músculo esquelético en ratas diabéticas tipo 2.
Introducción
En 2014, el 9% de los adultos mayores de 18 años en todo el mundo tenían diabetes, y la diabetes fue la causa directa de 1,5 millones de muertes (1, 2). Los efectos beneficiosos del ejercicio aeróbico regular para los diabéticos tipo 2 se han establecido bien, que incluyen la restauración del control glucémico y la resistencia a la insulina reducida sin hipertrofia muscular (3–6). Además, el ejercicio de resistencia regular reduce la glucosa en ayunas y la hemoglobina glucosilada (HbA1c) de pacientes diabéticos tipo 2 en estudios aleatorios y controlados (3–6). En un nivel molecular, un aumento en la expresión y translocación del transportador de glucosa 4 (GLUT-4) en el músculo esquelético después del entrenamiento de resistencia contribuye a la mejora del control glucémico (7). Además, la disminución de la masa del músculo esquelético se asocia con un deterioro de la resistencia a la insulina (8), por lo tanto, el aumento de la masa muscular en respuesta al entrenamiento de resistencia puede participar en la mejora del control glucémico.
Las hormonas esteroides sexuales, especialmente la testosterona y la 5α-dihidrotestosterona (DHT), juegan un papel importante en la regulación del metabolismo de la energía muscular e hipertrofia del músculo esquelético (9, 10). Anteriormente demostramos que la deshidroepiandrosterona (DHEA), un precursor de la hormona esteroide, se metaboliza a la testosterona y DHT en el músculo esquelético cultivado, lo que sugiere que el músculo esquelético es capaz de sintetizar localmente las hormonas esteroides sexuales (11, 12). Además, en nuestro estudio anterior sobre ratas diabéticas obesas, la suplementación crónica de DHEA aumentó los niveles de DHT muscular y la regulación positiva del metabolismo de la glucosa muscular a través de la translocación elevada de GLUT-4 e hipertrofia muscular esquelética (13). En pacientes diabéticos tipo 2 y ratas obesas hiperglucémicas y diabéticas tipo 2, los niveles de sangre y/o muscular de DHEA y su derivado de sulfato (DHEA-S) se reducen en comparación con los controles sanos ((13, 14). Nuestro estudio reciente mostró que el ejercicio de resistencia crónica elevó los niveles de DHT muscular, que se correlacionó con la hipertrofia del músculo esquelético inducido por el entrenamiento en pacientes mayores sanos (15). En consecuencia, estas hormonas esteroides pueden ser parte del mecanismo a través del cual el ejercicio de resistencia conduce a un mejor control glucémico con hipertrofia del músculo esquelético en pacientes con diabetes tipo 2. Sin embargo, no está claro si los aumentos inducidos por el ejercicio de resistencia crónica en el metabolismo esteroides del sexo muscular pueden contribuir a la mejora del metabolismo de la glucosa muscular y la hipertrofia del músculo esquelético en los diabéticos tipo 2.
Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar si 8 semanas de entrenamiento de resistencia pueden mejorar la esteroidogénesis muscular y si el aumento de los niveles de hormonas esteroides sexuales en el músculo esquelético contribuye a la mejora del metabolismo de la glucosa muscular e hipertrofia muscular esquelética en ratas diabéticas tipo 2. Para probar nuestra hipótesis, permitimos que las ratas diabéticas de Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF) participen en el ejercicio de resistencia con y sin infusión crónica de un inhibidor de 5α-reductasa, lo que resulta en una disminución de la conversión de la testosterona con el DHT, y evaluó los efectos de la resistencia de los aumentos inducidos por los esteroides de los esteroides de los esteroides de los esteroides sexuales en las hormonas de los esteroides sexuales. masa muscular.
Métodos
La aprobación ética de este estudio se obtuvo del Comité de Cuidado de Animales en la Universidad Ritsumeikan. Se obtuvieron ratas machos Oletf y Long-Evans Tokushima Otsuka (Leto) (6 semanas de edad) (Japón SLC, Shizuoka, Japón) y se atendieron de acuerdo con el Principios rectores para el cuidado y uso de animalesbasado en la Declaración de Helsinki. Las ratas se alojaron individualmente en una instalación de animales en condiciones controladas (12: 12 h de luz: ciclo oscuro, con el período de luz de 8:00 a.m. a 8:00 p.m.), y se les dio acceso al agua y alimentó a Chow Normal (CE2; Clea Japón, Tokio, Japón). Después de 14 semanas, las ratas OLETF de 20 semanas de edad se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 8 cada grupo): control sedentario (CON), entrenamiento de resistencia (RT) o entrenamiento de resistencia con infusión continua del inhibidor de la 5α-reductasa (RT+IN). El inhibidor de la 5α-reductasa (dutasteride; Sigma, Steinheim, Alemania) se administró continuamente a 0.15 μl por h durante 8 semanas a través de una mini bomba osmótica implantada en el tejido adiposo subcutáneo (Modelo 2006; Alzet, Cupertino, CA) (16, 17). El inhibidor (2 mg/kg) se disolvió en aceite de sésamo y se cargaron 200 μl en la bomba (16). Además, se usaron ratas Leto no diabéticas, sanas y de edad (n = 8) como controles. Los experimentos posteriores al tratamiento en ratas entrenadas se realizaron 48 h después de la última sesión de ejercicio para evitar efectos agudos del ejercicio. Todas las ratas se ayunaron durante 12 hy después de medir el peso corporal, se obtuvieron muestras de sangre de la aorta abdominal bajo anestesia general. Después del sacrificio, el corazón, la grasa epididimaria, el sóleo, el gastrocnemio y los músculos plantar se resecaron rápidamente, se enjuagaron en solución salina helada, pesaron y se congelaron en nitrógeno líquido. El músculo gastrocnemio se usó para evaluar las expresiones de enzimas esteroidogénicas y niveles de hormonas y realizar un análisis histoquímico del músculo esquelético, proporcionando así un estado esteroidogénico del tejido.
Protocolo de entrenamiento de resistencia
El entrenamiento de resistencia se realizó 3 días a la semana en días alternativos durante 8 semanas usando una escalera con longitud de 1,1 m, paso de cuadrícula 2.0 cm e inclinación de 80 ° según un estudio anterior (18). Las ratas en los grupos de entrenamiento subieron la escalera para 3 series de 4 repeticiones cada una, y se les permitió descansar entre series durante 1 minuto.
Análisis de inmunotransferencia
El análisis de transferencia Western se realizó como se describió anteriormente (16, 19). Brevemente, las proteínas musculares (40 μg) se separaron en geles SDS-poliacrilamida al 10%, y luego se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). The membranes were blocked for 1 h with blocking buffer (5% skim milk in phosphate-buffered saline with 0.1% Tween 20) and then incubated for 12 h at 4°C with primary antibodies against– 3β-HSD (sc-30820, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), 17β-HSD (sc-26963, Santa Cruz Biotecnología), receptor de andrógenos (SC-816, Santa Cruz Biotechnology), 5α-reductasa (#H00006715-D01P, Abnova Corporation, Taipei, Taiwán), serina (Ser)473-La Akt fosforilada (#9272, señalización celular, Beverly, MA), Akt total (#9272, señalización celular), PKC-ζ/λ (#9378, señalización celular) fosforilada o GLUT-4 (#07-1404, milipore), todos diluido a 1: 1000 en tampón bloqueador. La proteína de β-actina (SC-47778, Santa Cruz Biotechnology) se utilizó como control interno. Las membranas se lavaron tres veces con PBS-T, y luego se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP), que era una dilución anti-conejo (1: 3000 con amortiguador de bloqueo, GE Healthcare Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ, EE. UU. Biotecnología), o una dilución anti-ratón (1: 3000 con tampón de bloqueo, GE Healthcare Biosciences) inmunoglobulinas durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de estas reacciones, las membranas se lavaron tres veces con PBS-T. Finalmente, las proteínas se detectaron utilizando un sistema mejorado de quimioluminiscencia más (GE Healthcare Biosciences) y se visualizaron en un imágenes de imágenes LAS4000 (GE Healthcare Biosciences) (16).
Preparación de fracciones de proteína de membrana citosólica y plasmática
Para la determinación de la translocación GLUT-4, se usaron dos fracciones celulares diferentes como se describió anteriormente (16, 20, 21). Brevemente, las células se rasparon en tampón A que contiene (en MM) 20 Tris (pH 7,4), 1 EDTA, 0,25 EGTA, 1 DTT, 50 NAF, 25 pirofosfato de sodio, 40 β-glicerofosfato y 250 de sacarosa. Los homogeneizados resultantes se centrifugaron a 400 ×gramo durante 15 minutos para eliminar los escombros. El sobrenadante se centrifugó nuevamente a 50,000 rpm durante 1 h. El sobrenadante resultante utilizado como fracción de proteína de citosol. Además, el sedimento de diferentes fracciones se solubilizaron durante 1 hora a temperatura ambiente en el tampón B que contenía tris 20 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM, EGTA 0,25 mM, Triton X-100 al 2%, NAF 50 mM, pirofosfato de sodio 25 μM y 40 mm-glicerofosfato. El homogeneizado se centrifugó brevemente, y el sobrenadante se hizo girar durante 1 ha 50,000 rpm antes de que se usara como fracción de membrana plasmática. Los niveles de proteína GLUT-4 se midieron tanto en las fracciones de citosol como de membrana. La translocación se evaluó en función de la abundancia relativa de los niveles de proteína en estas fracciones (13, 16).
Inmunoensayo de enzima sándwich
Los niveles de DHEA en plasma y DHT en plasma, y los niveles de DHEA, testosterona libre y DHT en extractos de músculo esquelético se determinaron utilizando un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas sándwich (ELISA) (ELISA) (Diseños de ensayos, Ann Arbor, MI, USA, IBL Hamburg, Alemania). Los anticuerpos policlonales inmovilizados se elevaron contra DHEA, testosterona libre y DHT, mientras que los anticuerpos acoplados a HRP secundarios eran monoclonales. La densidad óptica a 450 nm se calificó en un lector de microplacas utilizando el espectrofotómetro de microplaca Xmark (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.). Todas las muestras fueron analizadas por duplicado.
Concentraciones de glucosa e insulina en ayunas
La glucosa en ayunas se evaluó desde la vena de la cola después del período de tratamiento en condiciones de ayuno durante la noche. Las concentraciones de glucosa se evaluaron tres veces desde la vena de la cola usando un medidor de glucosa en sangre (Ascensia, Bayer Healthcare, Tokio, Japón). Las concentraciones de insulina sérica se midieron usando un kit ELISA (Shibayagi, Gunma, Japón). La densidad óptica a 450 nm se cuantificó utilizando un lector de microplacas. Todas las muestras fueron analizadas por duplicado.
Sensibilidad a la insulina
Como índice de sensibilidad a la insulina, el índice cuantitativo de verificación de sensibilidad a la insulina (Quicki) se calculó de acuerdo con estudios previos de la glucosa en ayunas y la concentración de insulina (22–24). Quicki = 1/(log (i0) + log (g0)), donde yo0 es insulina en ayunas (μu/ml) y g0 es glucosa en ayunas (mg/dl).
