Resumen
Muchos estudios han intentado determinar las asociaciones entre los biomarcadores de sangre y el daño muscular inducido por el ejercicio. Sin embargo, se han informado malas correlaciones entre los cambios en los niveles de biomarcadores y la magnitud de los síntomas musculares. Los avances recientes en las herramientas proteómicas ofrecen una estrategia para el análisis integral de la expresión de proteínas, que puede usarse para identificar biomarcadores. Aquí, utilizamos un análisis proteómico para identificar proteínas urinarias que aparecen en respuesta a un ejercicio de elevación de terneros, incluidas las contracciones musculares excéntricas repetitivas, y descubrieron que una molécula de fragmentos N-terminal de titina (también conocida como Connectin) aparece en la orina después del ejercicio excéntrico. Medimos el fragmento de titina en muestras de orina de nueve individuos antes y después del ejercicio excéntrico utilizando un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas recientemente establecido y descubrió que la tasa de excreción de fragmento de titina aumentó 96 h después del ejercicio (5.1 a 77.6 pg/min, p <0.01). Los cambios en la tasa de excreción de fragmento de titina se correlacionaron fuertemente con los marcadores sanguíneos de daño muscular y con los síntomas musculares. Estos hallazgos sugieren que el fragmento de titina urinaria es potencialmente un biomarcador no invasivo del daño muscular.
Introducción
El daño muscular se induce fácilmente por el ejercicio excéntrico (1, 2), causando interrupción de la miofibra esquelética, infiltración de células inflamatorias y dolor muscular (3, 4), similar a la patología de la miopatía. La evaluación directa del daño muscular implica una evaluación morfológica del músculo esquelético (5, 6, 7). Sin embargo, a veces es difícil encontrar el tejido interrumpido porque la contracción muscular excéntrica induce la interrupción del músculo esporádico. Además, los investigadores generalmente dudan en tomar biopsia muscular debido a su invasividad, de modo que los investigadores han estado buscando formas no invasivas para evaluar la interrupción muscular para su uso tanto en los contextos clínicos como en el laboratorio.
Las actividades de las enzimas derivadas de los músculos en la sangre, como la creatina quinasa (CK), la lactato deshidrogenasa (LDH) y la proteína miocelular mioglobina (MB), que gotea en la circulación del músculo dañado, se han utilizado como marcadores indirectos del daño muscular (((8, 9, 10). Dolor muscular de inicio retrasado (DOMS) y los cambios en el rango de movimiento (ROM) también se han utilizado como indicadores de daño muscular (1, 11). Sin embargo, se han informado malas correlaciones entre los cambios en las concentraciones de marcadores de daño muscular y la magnitud de los síntomas musculares después del ejercicio excéntrico (12). También se ha informado que los niveles séricos de estos biomarcadores dependen del sexo, la masa muscular y la intensidad y la duración del ejercicio (2). También existe una notable variación interindividual en el grado en que las actividades enzimáticas séricas aumentan con el ejercicio (2, 13). Por lo tanto, hay muy pocos biomarcadores no invasivos y sensibles que reflejan con precisión el daño muscular inducido por el ejercicio.
Los avances recientes en herramientas proteómicas ofrecen una estrategia para el análisis integral de la expresión de proteínas, que se puede aplicar a la búsqueda de biomarcadores. De hecho, muchos estudios proteómicos ya se han utilizado para identificar biomarcadores entre proteínas séricas, urinarias y salivales para el diagnóstico temprano de diversas enfermedades, incluido el cáncer ((14) y la enfermedad de Alzheimer (15). En el contexto del daño muscular inducido por el ejercicio, Malm et al. informó que la expresión de varias proteínas relacionadas con la banda Z se detectó en el suero después del ejercicio excéntrico (16). Sietsema et al. informó que la alfa 1-anticimotripsina y los péptidos inhibidores de la proteasa C-1 aumentaron antes de CK después del ejercicio, y sugirieron estas proteínas como nuevos biomarcadores de lesión muscular (17). Sin embargo, hasta la fecha, ningún estudio ha utilizado proteómica para analizar proteínas urinarias después del ejercicio excéntrico.
En este estudio, realizamos un análisis proteómico integral para identificar proteínas urinarias que responden al ejercicio excéntrico agudo. Encontramos que un fragmento N-terminal de titina (también conocido como conectina) es detectable en orina después del ejercicio excéntrico. Luego establecimos un ensayo de inmunosorbente relacionado con la enzima cuantitativa (ELISA) para medir el fragmento de titina urinaria y evaluamos la utilidad del fragmento de titina urinaria como un biomarcador del daño muscular inducido por el ejercicio.
Materiales y métodos
Sujetos
Nueve hombres sanos participaron en la investigación original (18). En el presente estudio, las muestras de orina de esos sujetos se analizaron durante el período experimental. Las características medias (± DE) de los sujetos fueron las siguientes: edad 24.8 ± 1.3 años, masa corporal 62.3 ± 6.3 kg y altura 1.72 ± 0.05 m. Los sujetos recibieron instrucciones de mantener sus horarios diarios habituales durante el experimento. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Waseda, Japón, y los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito.
Diseño experimental
Los sujetos realizaron un ejercicio de cría de terneros, incluidas las contracciones musculares excéntricas repetitivas, con su pierna derecha en una placa de fuerza, como se describió anteriormente (18). Brevemente, cada sujeto descansaba en un dispositivo de ejercicio especialmente diseñado para la flexión plantar del tobillo, con la articulación de la rodilla extendida y el hueso metatarsiano que descansa sobre una heces. La pendiente del respaldo era de 30 °, de modo que la carga de ejercicio correspondía a aproximadamente la mitad del peso del sujeto (carga de ejercicio = masa corporal × sin 30 °). Con su pierna derecha, los sujetos realizaron un ejercicio de flexión plantar de tobillo de una sola pierna que consta de 10 conjuntos de 40 repeticiones con un descanso de 3 minutos entre conjuntos. La ROM de la articulación del tobillo durante el ejercicio se mantuvo entre 20 ° (posición de dorsiflexión) y 15 ° (posición de flexión plantar) utilizando un goniómetro electrónico (SG110/A, biometría, Newport, Reino Unido) con sus extremos unidos a la parte lateral distal de la peroné y la parte lateral del pie. Cada sujeto recibió comentarios visuales sobre su ROM conjunta de tobillo durante el ejercicio mediante la visualización del valor de la ROM conjunta en una computadora personal. El ejercicio se realizó de acuerdo con el ritmo de un metrónomo eléctrico a una velocidad de 60 recuentos/min; La dorsiflexión del tobillo y la flexión plantar se alternaron y se repitieron cada 1 s. Todos los sujetos completaron un total de 400 repeticiones de flexión plantar del tobillo. El dolor muscular de inicio retrasado (DOMS) se clasificó con una escala analógica visual (VAS): una línea de 100 mm con «sin dolor» en un extremo y «extremadamente dolorido» en el otro. La ternura del músculo ejercido correlativo con DOMS se evaluó utilizando el medidor FP (SN-402, Navis, Japón) a 1 kg. El punto de medición era el punto medio del gastrocnemio medial (9). Se recogieron muestras de sangre y orina antes y 2, 4, 24, 48, 72 y 96 h después del ejercicio. Las mediciones de MB en suero se realizaron como se describió anteriormente (18). Sero CK, LDH y aldolasa (ALD) se midieron según lo descrito por Kanda et al. (9, 18).
La proteína de la orina humana se concentra
Las muestras de orina se centrifugaron inmediatamente a 1000 × g durante 10 minutos para eliminar el sedimento, y los sobrenadantes se almacenaron a –80 ° C para su posterior análisis. Las muestras de 50 ml fueron transferidas a Amicon® Concentradores de membrana de filtro centrífugo ultra 4 (corte de peso molecular 3k; cat. No (pH 8.8)) se agregó a las muestras. Las cantidades de proteína en los concentrados de orina se midieron con el kit de ensayo BCA (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) Y se congelaron a –80 ° C para un análisis posterior.
Electroforesis e imágenes de gel
Se rehidrataron las tiras de gradiente de pH inmovilizada (IPG) (pH 3-10, 24 cm) y las muestras preparadas se aplicaron con carga de copa. El enfoque isoeléctrico se realizó con una unidad de electroforesis multiphor ™ II (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Bucks, Reino Unido) por 54 kVH a 20 ° C en la oscuridad (19, 20). Las tiras se equilibraron durante 10 minutos en tampón (tris-HCL 50 mM (pH 8.8), urea 6 M, 30% (v/v) de glicerol, 1% (p/v) dodecil sulfato de sodio (SDS)) que contiene dithiothreitol 65 mM, y luego durante 10 minutos en el mismo tampón que contiene 240 mM IODOACETAMIDA. Las tiras de IPG equilibradas se transfirieron a 24 cm × 20 cm, 12% T, geles de poliacrilamida C 7,5% hechos entre placas de vidrio de baja fluorescencia. Las tiras fueron superpuestas con agarosa de bajo punto de fusión al 0,5% (p/v) en tampón (base tris a 25 mM, SDS al 0,1%, 192 micina) que contiene azul de bromofenol al 0,1%. Los geles se ejecutaron en el sistema de electroforesis de Ettan Dalt Doce (Amersham Biosciences) a 2 W/gel a 20 ° C, hasta que los frentes de tinte salieron corriendo del fondo de los geles. Los geles bidimensionales (2-D) entre las placas de vidrio de baja fluorescencia se escanearon directamente con un Typhoon 9400 Imager (Amersham Biosciences). La normalización de los tres tintes cy ™ se logró ajustando los valores máximos de píxeles a 55.000 recuentos cambiando el fotomultiplador Voltaje del tubo. Las imágenes generadas se exportaron como imágenes etiquetadas (Amersham Biosciences).
Análisis de imágenes
El análisis diferencial en gel con Decyder ™ se utilizó para fusionar las imágenes Cy2, Cy3 y Cy5 para cada gel, y para detectar los límites de mancha para calcular los volúmenes de mancha/abundancia de proteínas normalizadas. En esta etapa, se filtraron características resultantes de fuentes no de proteínas (por ejemplo, partículas de polvo, rayas) y puntos débiles (por ejemplo, áreas puntuales ≤ 300, volúmenes puntuales ≤ 10.000). El análisis se utilizó para calcular las diferencias de abundancia entre las muestras ejecutadas en el mismo gel. El análisis de variación biológica (BVA) de Decyder ™ se usó luego para que coincida con todas las comparaciones de imágenes por pares del DIA para un análisis estadístico comparativo de gel cruzado. La comparación de los volúmenes de puntos Cy3 y Cy5 normalizados con los volúmenes de punto estándar CY2 correspondientes dentro de cada gel dio la abundancia estandarizada. Este valor se comparó en todos los geles para cada punto coincidente. Todos los geles analizados se combinaron con un «gel maestro» para asignar el mismo número al mismo punto de proteína. La imagen del gel maestro se obtuvo de la muestra agrupada derivada de todas las muestras de orina.
Digestión en gel y extracción de péptidos
La electroforesis en gel para el análisis de espectrometría de masas (MS) se realizó con los procedimientos descritos anteriormente (electroforesis e imágenes de gel). Después de la electroforesis, el gel se fijó en metanol al 10% (v/v): 7% (v/v) ácido acético y se tiñó con sypro® Rubí. Este gel para el análisis de MS se combinó con el gel maestro para el análisis de expresión con el software BVA. Según las instrucciones del fabricante, se extrajeron puntos de interés de los geles bidimensionales (2D) utilizando un selector de manchas automatizado (Amersham Biosciences), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los puntos se recogieron en 200 ml de agua en placas de 96 pocillos. Las piezas de gel recuperadas se lavaron con bicarbonato de amonio y acetonitrilo de 50 mM (ACN) de 50 mM (ACN), y luego se incubaron con 12.5 ng/ml de tripsina (Promega, Southampton, Reino Unido) a 30 ° C durante 15 h. Los péptidos generados se eluyeron con bicarbonato de amonio 50 mM seguido de ácido fórmico al 10% (v/v) y ACN. Las fracciones combinadas se secaron en un Veleo Vacel y se disolvieron en ácido fórmico al 0,1% (v/v).
Análisis de MS
El análisis de MS se realizó con Dige (21, 22). Un aparato de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (CAPLC, Waters, Milford, MA, EE. UU.) Se acopló a un espectrómetro de microma de vuelo en el tiempo cuadrupolo (MicromaSs, Manchester, Reino Unido). La operación del instrumento y la adquisición y el análisis de datos se realizaron con el software MassLYNX 3.2 (Micromass). Los péptidos trípticos se concentraron y desalaron en una columna PEPMAP C18 de ID/5 mM de 300 mM (LC Packings, San Francisco, CA, EE. UU.). El péptido eluido se analizó con secuenciación MS/MS con un protocolo automatizado de conmutación MS-a MS/MS. Las masas de iones precursores se determinaron en línea en un rango m/z de 400-1600 amu en el modo de detección de carga positiva, con un voltaje de cono de 50 V. El voltaje de cono, el voltaje de extracción, el voltaje del detector de la placa de microchannal y la energía de colisión se optimizaron antes de la medición de …
