Resumen
Los estudios clínicos y en animales sugieren que el ejercicio puede ser una forma efectiva de controlar las condiciones de dolor inflamatorio y neuropático. Sin embargo, los estudios en animales existentes comúnmente usan paradigmas de ejercicio forzados que incorporan diversos grados de estrés, que pueden provocar analgesia y, por lo tanto, pueden complicar la interpretación de los efectos del ejercicio sobre el dolor. Investigamos el potencial analgésico de la rueda voluntaria en el modelo de formalina del dolor inflamatorio agudo y el modelo de lesión nerviosa salvada del dolor neuropático en ratones. En ratones C57BL/6J adultos no lesionados, 1 a 4 semanas de entrenamiento del ejercicio no alteraron los umbrales nociceptivos, la excitabilidad neuronal de los ganglios dorsales lumbares o la inervación intraepidérmica de la pata trasera. Además, el entrenamiento ejercicio no logró atenuar el dolor espontáneo inducido por formalina. Por último, 2 semanas de entrenamiento ejercicio fueron ineficaces para revertir la hipersensibilidad mecánica inducida por la lesión nerviosa salvada o en la mejora del desgaste muscular o la denervación de pata trasera. Estos hallazgos indican que, en contraste con los paradigmas de ejercicio forzado de roedores, las duraciones cortas de la rueda voluntaria no mejoran los síntomas similares a los de los ratones de inflamación aguda y lesión nerviosa periférica.
Introducción
El dolor crónico es una condición debilitante que afecta a más de 100 millones de estadounidenses y tiene un costo anual de $ 635 mil millones en forma de gastos de atención médica y pérdida de productividad (1,2). Los estudios clínicos sugieren que el ejercicio aeróbico es un enfoque efectivo y no invasivo para el manejo de condiciones de dolor inflamatorias y neuropáticas continuas, así como trastornos musculoesqueléticos (3–7). Del mismo modo, el ejercicio mejora los síntomas similares al dolor en los modelos de dolor inflamatorio y neuropático de roedores (8–20).
El efecto del ejercicio sobre el dolor se ha evaluado principalmente utilizando paradigmas de ejercicio forzado. Por ejemplo, estudios recientes han demostrado que la cinta de correr forzada en funcionamiento después de la lesión nerviosa periférica revierte la hipersensibilidad térmica y mecánica inducida por la lesión nerviosa en ratas y ratones (9–11,21,22). También se ha demostrado que la natación extendida atenúa el desarrollo y la hipersensibilidad térmica y mecánica inducida por la lesión nerviosa inversa en roedores, así como dolor espontáneo inducido por formalina en ratas (8,14,20). Como se reconoce en estos estudios y otros, el ejercicio forzado puede provocar respuestas de estrés agudas y crónicas que a su vez pueden producir analgesia (23–28). Aunque la mayoría de los estudios de ejercicio forzado han evaluado los umbrales nociceptivos después de que las respuestas de estrés agudo inducido por el ejercicio se han resuelto, el ejercicio forzado prolongado da lugar a respuestas de estrés crónico en algunos casos (23,25,26). El ejercicio voluntario también puede provocar una respuesta al estrés (24); Sin embargo, numerosos estudios demuestran efectos ansiolíticos de la rueda voluntaria prolongada en casos de estrés leve a moderado (29–33). Una forma de minimizar posibles complicaciones de los efectos dependientes del estrés sobre el dolor es utilizar paradigmas de ejercicio voluntario.
Se ha demostrado que el funcionamiento voluntario de la rueda es efectivo para retrasar las disminuciones en los umbrales de abstinencia muscular y una mayor frecuencia de abstinencia de pata en modelos de dolor muscular crónico (13). Del mismo modo, en un modelo de neuropatía prediabética alta en grasas, la carrera voluntaria revierte la hipersensibilidad mecánica y visceral (17). Si bien estos estudios apoyan que el funcionamiento voluntario de la rueda mejora el comportamiento similar al dolor en los roedores, los informes que utilizan paradigmas de ejercicios voluntarios en estados de dolor lesionados y no lesionados son limitados.
Para investigar si las repetidas sesiones de ejercicio voluntario alteran la nocicepción basal en roedores, determinamos si el funcionamiento voluntario de la rueda cambia los umbrales nociceptivos, la excitabilidad de las neuronas sensoriales o la inervación de la piel en ausencia de lesiones. También investigamos si el entrenamiento voluntario altera las respuestas agudas del dolor inflamatorio, así como el hipersensibilidad, el desgaste muscular o la denervación de la piel inducida por el modelo de lesión nerviosa ahorrada (SNI) de dolor neuropático. Reportamos que el funcionamiento voluntario de las ruedas no alteró los umbrales nociceptivos en ratones no lesionados, y no fue efectivo en la atenuación de dolor inflamatorio agudo o de lesión nerviosa inducida.
Materiales y métodos
Declaración de ética
Todo el estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de la Universidad de Washington en el Departamento de Medicina Comparada de St. Louis (DCM). El protocolo fue aprobado por el Comité de Estudios Animales de DCM (Número de protocolo: 20130147).
Animales
Los ratones machos C57BL/6J adultos criados en casa u obtenidos de Jackson Labs fueron alojados y atendidos de conformidad con el Comité de Estudios Animales de la Universidad de Washington en St. Louis. Los ratones fueron alojados en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas (HR) y tenían ad libitum Acceso a la comida y el agua mientras se encuentra en sus jaulas de origen. Se iniciaron experimentos de comportamiento en ratones de 7 a 10 semanas de edad. En el transcurso de las pruebas, la lesión (si corresponde) y el entrenamiento ejercicio, los ratones alcanzaron una edad máxima de 14 semanas. Al concluir las pruebas de comportamiento, los ratones fueron sacrificados utilizando un cóctel de eutanasia de ketamina de roedores.
Paradigma de ejercicio
Durante el entrenamiento ejercicio, los ratones se colocaron en jaulas individuales con ruedas de carrera inalámbrica de bajo perfil (Med Associates Inc.) durante 2 horas (6–8 pm) o 12 horas (7 pm-7 am) por noche, 5–6 noches a la semana. Se requirió una sexta noche de entrenamiento para mantener los estados de ejercicio durante las pruebas de comportamiento. La distancia RAN se monitoreó utilizando software de Med Associates Inc. Los animales de control se colocaron en jaulas individuales con una rueda de carrera bloqueada. Durante las sesiones de entrenamiento de 2 horas, se usó ruido blanco para enmascarar ruidos externos. Los animales entrenados durante la noche recibieron gránulos e hidrogeles (Clearh2O) para evitar la pérdida de peso. El acceso a la jaula doméstica a las ruedas para correr, ya sea desbloqueado o bloqueado, no se utilizó en nuestros estudios para minimizar el estrés asociado con el aislamiento social crónico de viviendas individuales (34). Cuando no hacía ejercicio, los animales fueron alojados en el grupo en sus jaulas de origen.
El entrenamiento ejercicio se completó antes de la inducción del dolor inflamatorio agudo, que tuvo lugar la tarde siguiente a la última pelea de ejercicios. Específicamente, la formalina intraplantar se administró 16 horas después de la finalización de sesiones de ejercicio de 2 horas/noches o 4–6 horas después de la finalización de las sesiones de ejercicio de 12 horas/noche. En estudios de lesiones nerviosas, el entrenamiento en ejercicio comenzó 8-10 días después de la cirugía.
Estudios de comportamiento
Todos los ensayos de comportamiento se completaron entre las 8 a.m. y las 5 p.m. Brevemente, para los ensayos de Hargreaves, Von Frey y Cold Plantar, los ratones se aclimataron en cajas de plexiglás a la plataforma de prueba y el ruido blanco durante al menos 2 horas antes de las pruebas hasta que cesara el comportamiento exploratorio. Para la placa caliente y las pruebas de pantalla invertidas, los ratones se aclimataron a la sala de pruebas en su jaula casera con ruido blanco durante al menos 1 hora antes de la prueba. Para todos los estudios de comportamiento, el experimentador fue cegado a grupos de entrenamiento.
Ensayo plantar frío
La sensibilidad al frío se midió como se describió anteriormente (35,36). Los ratones se aclimataron a una placa de vidrio de 3/8 «o 1/4» y se hizo una sonda fría empacando hielo seco finamente triturado en una jeringa modificada de 1 cm de diámetro. La sonda fría se aplicó al vidrio debajo de la superficie plantar de la pata trasera y se registró el tiempo de la retirada de la pata. Se realizaron 5 ensayos en cada pata trasera, con 7 minutos (min) entre pruebas en patas opuestas, y 15 minutos entre los ensayos en la misma pata. Se usó una latencia de corte de 20 segundos (segundos) para evitar el daño tisular. Las latencias de retiro se determinaron promediando respuestas de la pata derecha e izquierda.
Cosechadoras
Los animales se aclimataron en una placa de vidrio que se mantiene a 30 ° C (Modelo 390 Serie 8, IITC Life Science Inc.). Se aplicó una fuente de calor radiante a la pata trasera y se registró la latencia para la retirada de la pata (37). Se realizaron 5 pruebas en cada pata, con al menos 5 minutos entre probar la pata opuesta y al menos 10 minutos entre probar la misma pata. Para evitar el daño tisular, se estableció una latencia de corte de 20 segundos. Se promediaron los valores de ambas patas para determinar la latencia de retirada.
Plato caliente
Antes del día de prueba, los animales se aclimataron individualmente a la cámara de placa caliente (Modelo PE34 Series 8, IITC Life Science Inc.) durante 15 minutos. El día de la prueba, se realizó un ensayo experimental en el que cada animal se colocó en una placa de 55 ° C y se registró la latencia a la respuesta. La «respuesta» se definió como el primer acto dirigido hacia la pata trasera, que era principalmente lamiendo o temblando, o un comportamiento de escape como saltar. Se usó una latencia de corte de 20 segundos para prevenir el daño tisular.
von Frey
Los ratones se aclimataron en una rejilla de malla elevada y la sensibilidad mecánica se determinó aplicando filamentos de von Frey a la pata trasera plantar de acuerdo con el método hacia abajo como se describió anteriormente (38). Se realizaron tres pruebas en cada pata con al menos 5 minutos entre ensayos en patas opuestas, y 10 minutos entre los ensayos en la misma pata. Se obtuvieron los umbrales de abstinencia de la pata mecánica de animales no lesionados promediando los 3 ensayos realizados en ambas patas. Los animales con lesiones nerviosas se probaron en el aspecto lateral de la pata trasera tanto en los puntos de tiempo de base y después de la lesión, y se calcularon los umbrales promedio de abstinencia de ipsilateral (39).
Prueba de formalina
Para el dolor inflamatorio agudo, los ratones se aclimataron en cajas de plexiglás en una plataforma de vidrio durante 1 hora con ruido blanco. Los ratones se eliminaron brevemente de la plataforma y se inyectaron 10% de formalina al 2% subcutáneamente en la pata trasera. Los ratones fueron grabados en video durante 1 hora después de la inyección de formalina y el tiempo dedicado a lamer y levantar la pata después de la inyección se anotó en contenedores de 5 minutos fuera de línea. Para minimizar los posibles efectos agudos del ejercicio sobre el comportamiento (40,41), la prueba de formalina se realizó al menos 16 horas después de la sesión de entrenamiento final de 2 horas, y al menos 4 horas después de la sesión final de entrenamiento nocturno.
Prueba de pantalla invertida
Para evaluar la fuerza muscular, a los ratones se les permitió agarrar una cuadrícula de malla. La cuadrícula se invirtió luego hasta que los ratones estuvieron al revés y la latencia de la caída se registró, utilizando una latencia de corte de 120 segundos. Se realizaron dos pruebas con al menos 1 hora de descanso permitidas entre los ensayos (42).
Disociando neuronas DRG
Los ratones se sacrificaron mediante decapitación viva y los ganglios de raíz dorsales lumbares (L) (DRG) 3-5 se diseccionaron de los ratones de control y ejercicio de ratones entrenados. DRG se incubó en papaína (45U) durante 20 minutos, se enjuagaron y se incubaron con colagenasa (4.5 mg/200 μl) durante 20 minutos. DRG se trituró para disociar neuronas y se filtraron con un filtro de malla de 40 μm. Las células disociadas se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos de poli-D-lisina/colágeno y se analizaron de 12 a 24 h después del enchapado.
Electrofisiología
Se realizaron grabaciones de células enteras en la abrazadera de corriente en células de 20 a 30 μm de diámetro para aumentar la probabilidad de registrar a partir de neuronas nociceptivas. Las pipetas de vidrio pulido con fuego se sacaron con un extractor de micropipette P-97 (Sutter Instrument Company), y las resistencias de la punta abierta variaron de 2.0–7.0 MΩ. Las pipetas se llenaron con una solución de grabación interna que consiste en (en mm): 120 K+ + gluconato, 5 NaCl, 2 MgCl20.1 caCl210 Hepes, 1.1 Egta, 4 na2ATP, 0.4 na2GTP, 15 fosfocreatina; pH = 7.3, 291 MOSM. Al registrar, las células se perfundieron continuamente con una solución externa de temperatura ambiente que consiste en (en mm): 145 NaCl, 3 kcl, 2.5 caCl21.2 mgcl210 Hepes, 7 glucosa, ajustado a pH 7,4 con NaOH. La resistencia en serie de cada grabación fue inferior a 20 MΩ. El software PatchMaster (Heka Instruments Inc.) que controlan un amplificador USB EPC10 (Heka Instruments Inc.) se utilizó para grabar a partir de neuronas. Solo las neuronas con un potencial de membrana en reposo más negativo que -45 MV se incluyeron en el análisis de datos.
Modelo de lesión nerviosa
A lo largo de la cirugía, los ratones se mantuvieron bajo anestesia de isofluorano. Se realizó una incisión en la piel y el músculo bíceps femoral se separó para exponer las ramas del nervio ciático. Sin manipular la rama del nervio sureal, los braquones peronales y tibiales comunes se ligaron con 6-0 …
