Resumen
Las dietas altas en grasa (HF) en combinación con estilo de vida sedentario representan una de las principales preocupaciones de salud pública que predisponen la obesidad y la diabetes que conducen a la atrofia muscular esquelética, la disminución del diámetro de la fibra y la masa muscular con la acumulación del tejido grasa, lo que resulta en la pérdida de la fuerza muscular. Una estrategia para superar los efectos maléficos de la dieta de HF es el entrenamiento de resistencia, una estrategia utilizada para mejorar la masa muscular, revirtiendo los efectos negativos en los cambios relacionados con la obesidad en el músculo esquelético. Junto con el entrenamiento de resistencia, la suplementación con monohidrato de creatina (CRM) en la dieta se ha utilizado para mejorar la masa muscular y la fuerza. La creatina es un aminoácido no esencial que está directamente involucrado en el ciclo de puente cruzado que proporciona un grupo de fosfato a ADP durante el inicio de la contracción muscular. Además de sus efectos antioxidantes y antiinflamatorios, CRM también regula al alza IGF-1, lo que resulta en hiperthofia con un aumento en la función muscular. Sin embargo, se desconoce si la suplementación con CRM durante el entrenamiento de resistencia revertiría los efectos negativos de la dieta alta en grasas en el rendimiento muscular. Durante 8 semanas, medimos el rendimiento muscular para escalar una escalera de 1.1m y 80 ° con una carga creciente en ratas entrenadas que habían recibido una dieta estándar o una dieta alta en grasas, suplementada o no con CRM. Observamos que los niveles de proteína IGF-1 y fosfo-AKT regulados por CRM y suplementación con la ruta IGF1-PI3K-AKT/PKB-MTOR. Además, a pesar de la suplementación de CRM, la dieta HF reguló a la baja varias proteínas de la vía IGF1-PI3K-AKT/PKB-MTOR, lo que sugiere que el contenido de lípidos de la dieta es crucial para mantener o mejorar la función muscular durante el entrenamiento de resistencia.
Introducción
Las dietas altas en grasas (HF) y el estilo de vida sedentario representan una preocupación de salud pública que puede predisponer a la obesidad y la diabetes (1), que puede conducir a la atrofia del músculo esquelético debido a la degradación de las fibras musculares, una reducción de la fibra tipo 1 (metabolismo aeróbico) y con un aumento de la fibra tipo 2X (metabolismo glicólico) (2, 3). La obesidad se caracteriza aún más por la pérdida de la fuerza muscular, la disminución del diámetro de la fibra y la masa muscular con la acumulación de tejido grasa (4). El músculo esquelético constituye alrededor del 40-50% de la masa corporal y es el principal tejido sensible a la absorción de glucosa y ácidos grasos estimulados por insulina. A nivel celular, las dietas de HF inducen la disfunción mitocondrial que conduce a la resistencia a la insulina y reduce la masa muscular mediante la disminución de los niveles de proteína del IGF1-PI3K-AKT/PKB-MTOR SHELELELGHING MUSHING VATA proteína quinasa (AKT) (5). Además, la obesidad regula la miostatina (GDF-8), un miembro de la familia del factor de crecimiento transformador-β (TGF-β1), FOXO, óxido nítrico sintasa inducible y CSP3; Todos los miembros de la vía de atrofia muscular (3, 6). Aunque tanto las vías anabólicas como los catabólicos están bien descritas, es decir, Akt inhibe que Foxo y Myostatin-Smad 2/3 inhibe AKT (3), la regulación exacta del metabolismo de las proteínas durante la obesidad todavía se caracteriza incompletamente (7).
El entrenamiento de resistencia como tratamiento estratégico de la rehabilitación física contra la obesidad da como resultado una mayor capacidad de generación de fuerza, mejora muscular mejorada y efectos positivos en los cambios relacionados con la obesidad en el músculo esquelético (8). Esta técnica aumenta la expresión de IGF-1, que en el ratón disminuye la expresión de miosina 2b y aumenta la expresión de miosina 2X, mientras que en los humanos, hay una regulación negativa de la miosina 2X intermedia rápida y una regulación positiva de la miosina 2A intermedia rápida (2).
Un método para mejorar la efectividad del entrenamiento de resistencia es la suplementación con monohidrato de creatina (CRM) en la dieta. CRM se ha utilizado no solo para los atletas como una ayuda ergogénica para mejorar la masa muscular y la fuerza, sino también como agente terapéutico para pacientes que padecen sarcopenia, desgaste muscular y miopatías (9–11). La creatina es un aminoácido no esencial que se sintetiza en el hígado y el riñón o se ingiere de la carne o los suplementos artificiales. En el músculo, la creatina se encuentra como creatina libre o fosfocreatina, ambos están directamente involucrados en el ciclo de puente cruzado que proporciona grupos de fosfato a ADP durante el inicio de la contracción muscular (11). CRM tiene un efecto antioxidante y antiinflamatorio, reduciendo la peroxidación lipídica y la susceptibilidad al ADN al estrés oxidativo (12–15). También se ha demostrado que CRM regula IGF-1 en miotubos cultivados (16) y en el músculo esquelético humano, lo que resulta en hipertrofia con un aumento de la función muscular (10, 17, 18). El mecanismo preciso por el cual CRM regula al alza IGF1 y, por lo tanto, la diferenciación de las fibras musculares miogénicas y la hipertrofia sigue siendo desconocida. La estrategia para usar la suplementación de CRM en la obesidad asociada con la respuesta hipertrófica durante el entrenamiento de resistencia ha producido resultados positivos dependiendo de la dosis, la duración del tratamiento y del tipo de entrenamiento físico (10). Por lo tanto, todavía hay lagunas con respecto al efecto del suplemento CRM en el rendimiento muscular durante el entrenamiento de resistencia durante la dieta alta en grasas. Para probar esta hipótesis, comparamos la capacidad muscular de las ratas entrenadas que recibieron una dieta estándar o alta en grasas, suplementadas con CRM o no para escalar una escalera (1,1 m de altura a 80 ° de inclinación) con cargas crecientes durante 8 semanas. Observamos que la mejora del rendimiento muscular observado en ratas entrenadas que reciben una dieta estándar suplementada con CRM se canceló por completo bajo la dieta HF.
Materiales y métodos
Cuidado y uso de animales
Cuarenta ratas wistar machos (Hanunib; Rattus novergucis) se obtuvieron de la colonia de reproducción en la Universidad Estatal de Campinas (CEMIB-UNICAMP) y mantenidos por nuestro centro de atención institucional de animales. Las ratas se mantuvieron en jaulas colectivas (2–3 animales por jaula) a temperatura constante (21 ± 2 ° C), ciclos de luz de 12 h de luz/ 12 h de oscuridad y con acceso libre a alimentos y agua. Todos los procedimientos animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y el uso de animales de laboratorio. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales FMJ (Número de proceso 490/2012).
Grupos experimentales
En el momento de los experimentos, todos los animales tenían 24 semanas de edad y se asignaron al azar en los siguientes ocho grupos experimentales de acuerdo con su dieta, entrenamiento y suplementación de creatina: i) dieta estándar no entrenada (SD; n = 5), ii) no capacitado de creatina suplementaria (SD-CRM; n = 5), iii) entrenamiento de resistencia (SD-T; n = 5), entrenamiento de resistencia con creación (SD-CRM; N = 5), iii) entrenamiento de resistencia (SD-T; n = 5), entrenamiento de resistencia IV) suplementado con creación (SD-CRM; N = 5), iii) Entrenamiento de resistencia (SD-T; N = 5), entrenamiento de resistencia IV) con el entrenamiento de la creación (SD-CRM; SD-CRM; 5), v) Dieta alta en grasas no entrenada (HF; n = 5), vi) HF no entrenado con creatina (HF-CRM; N = 5), vii) HF y entrenamiento de resistencia (HF-T; n = 5) y VIII) entrenamiento de resistencia con suplementación de creatina (HF-T-CRM; N = 5).
Dieta
Los animales de SD, SD-CRM, SD-T y SD-T-CRM recibieron una dieta estándar (Nuvital, Nuvilab, Brasil) que contenía 71 g de carbohidratos, 23 g de proteína, 6 g de grasa total y 5 g de fibra, totalizando 3.8 kcal/g. Ocho semanas antes del comienzo de los experimentos y durante las ocho semanas de procedimientos experimentales, los grupos de ratas de obesidad (HF, HF-CRM, HF-T y HF-T-CRM) recibieron una dieta alta en grasas (Nuvital, Nuvilab, Brasil) que contenía 38 g de carbohidratos, 15 g de proteína, 46 g de grasa total y 5G de fibra, total de 5.4 kcal/gal. Los animales tenían libre acceso al agua y al chow durante el período experimental. La suplementación CRM (300 mg/kg/día) fue dada diariamente por Gavage desde el día 1 hasta el último día del procedimiento experimental.
Protocolo de entrenamiento de resistencia
En la semana 15 antes del comienzo de los experimentos, los grupos de entrenamiento de resistencia (SD-T, SD-T-CRM, HF-T y HF-T-CRM) se sometieron a sesiones de escalada tres veces por semana durante 8 semanas, según Cassilhas y compañeros de trabajo ((19). Las ratas se adaptaron a escalar una escalera vertical (1.1 x 0.18 m, cuadrícula de 2 cm, 80 ° de inclinación) con peso unido al cilindro halcón recortado a la base de la cola envuelta con cinta hipoalergénica de papel (3M (3MTM MicroporosTM). La longitud de la escalera conduce a 8–12 movimientos por subida. Se realizó una adaptación de tres días una semana antes de la sesión de entrenamiento. El entrenamiento de escalada consistió en dos subidas introductorias, seguidas de tres intentos de escalada de longitud completa. Primero, el animal se colocó en la parte superior de la escalera cerca del área de descanso (40x20x20 cm). Las ratas estaban motivadas para escalar por un toque a la cola con pinzas. En segundo lugar, las ratas se colocaron en el medio de la escalera y se aplicó un estímulo externo para alentar la escalada. Finalmente, durante los siguientes tres intentos de escalada de longitud completa, las ratas subieron desde la base del equipo hasta la parte superior de la escalera. La escalada de adaptación se realizó usando solo el peso corporal. La primera sesión de entrenamiento comenzó dos días después del período de adaptación con el 50% del peso corporal unido a cada animal. Se agregaron una serie de pesos de 30 g hasta que la carga máxima gravó la capacidad de la rata para ascender y consistió en subidas de cuatro a doce escaleras. Después de cada escalada exitosa desde la parte inferior hasta la parte superior de la escalera, a las ratas se les permitió descansar durante 120 segundos. El fracaso se definió después de tres intentos no exitosos. La carga de transporte máxima se consideró la carga más alta antes de los intentos fallidos. La sesión de entrenamiento consistió en cuatro subidas con 50%, 75%, 90% y 100% de la carga de transporte máxima de la rata. Después de cada cuarta subida, se agregaron pesos adicionales de 30 g hasta que se determinó la nueva carga de transporte máxima.
Análisis cuantitativo de la capacitación
La carga de transporte máxima se determinó por la cantidad total de carga transportada a la parte superior de la escalera. La contracción isotónica total medida en gramos se calculó sumando el peso corporal y el peso se elevó a la parte superior de la escalera, el número de repeticiones (el número de veces que la rata subió con éxito a la parte superior de la escalera). El trabajo medido en Kilo Joule (KJ) se calculó multiplicando la masa total elevada a la parte superior de la escalera, la longitud de la escalera (1.1m), fuerza gravitacional (9.8 06 ms-2) y el ángulo de la escalera (sen80 ° = 0.9848).
Recolección de muestras y preparación de tejidos
Después de que las ratas descansaron durante 48 h después de la última sesión de escalada, se anestesiaron con una mezcla de ketamina (80 mg/kg de peso corporal) y xilazina (12 mg/kg de peso corporal) y el gastrocnemio izquierdo y derecho se disecó rápidamente y uno se congeló en N -Hexano enfriado en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 ° C. Los músculos congelados fueron con sección transversal transversal (secciones de criostato de 8 μm de espesor), y luego se tiñeron con Heamtoxylin-Eosin (HE) para el análisis histológico, donde el diámetro de fibra mínimo de Feret se calculó utilizando el software IMAGEN J 1.51F (Instituto Nacional de Salud, EE. UU.). Utilizamos el diámetro mínimo de Feret debido al hecho de que principalmente de las secciones eran perpendiculares al eje largo del músculo y, por lo tanto, una desviación mínima del eje largo perpendicular podría introducir artefactos en las mediciones. Los tamaños de fibra de cada condición experimental se determinaron a partir de 5-7 imágenes capturadas al azar.
Determinación de los niveles de proteína
Muscle samples from the second gastrocnemius of each rat were lysed in assay lysis buffer containing freshly added protease and phosphatase inhibitors (1% Triton X-100, 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM sodium pyrophosphate, 100 mM NaF, 10 mM sodium ortho-vanadium, 10 mM EDTA, 2 mM PMSF, and 10 μg/ml aprotinin). Las muestras se centrifugaron durante 20 minutos a 11,000 rpm, y la fracción soluble se resuspendió en 50 μl de tampón de carga LAEMMLI (2% de SDS, 20% de glicerol, 0.04 mg/ml de azul de bromofenol, Tris-HCl 0.12 M, pH 6.8 y 0.28 m βcaptoetanol). Las muestras se almacenaron a -80 ° C hasta el análisis. Las proteínas se resolvieron en geles de 8% al 12% de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Los anticuerpos primarios se diluyeron en TBS que contenía Tween al 0,05% (TBS-T). Las membranas se incubaron durante la noche con primaria …
