Resumen
La señalización a través del receptor de tipo 4-melanocortina (MC4R) es un determinante importante del peso corporal en ratones y humanos, donde la pérdida de mutaciones de la función conduce a una obesidad significativa. Los humanos con mutaciones en el MC4R experimentan un aumento en la masa magra. Sin embargo, la acumulación simultánea de la masa de grasa en tales individuos puede contribuir a este efecto a través de la carga mecánica. Por lo tanto, examinamos la relación de la masa grasa y la masa magra en ratones que carecen del receptor de melanocortina tipo 4 (MC4RKO). Demostramos que los ratones Mc4rko muestran una mayor masa corporal magra. Además, esto no depende de los cambios en la masa adiposa, ya que los ratones MC4RKO poseen más masa corporal delgada que los ratones obesos (DIO) inducidos por la dieta (DIO) con una masa grasa equivalente. Para examinar las fuentes potenciales del aumento de la masa magra en ratones MC4RKO, se examinaron la masa ósea y la resistencia en ratones Mc4RKO. Ambos parámetros aumentan con la edad en ratones MC4RKO, lo que probablemente contribuye a los aumentos en la masa corporal magra. Caracterizamos funcionalmente el aumento de la masa magra en ratones Mc4rko al examinar su capacidad para correr en la cinta de correr. La deficiencia de MC4R da como resultado una disminución en el rendimiento del ejercicio. No se observaron cambios en la relación de fibras oxidativas a las fibras glucolíticas, sin embargo, los ratones MC4RKO demuestran una frecuencia cardíaca significativamente reducida, lo que puede ser la base de su rendimiento de ejercicio deteriorado. La capacidad de ejercicio reducida que informamos en el ratón MC4RKO tiene ramificaciones clínicas potenciales, ya que los esfuerzos para controlar el peso corporal en humanos con deficiencia de melanocortina pueden ser ineficaces debido a la mala tolerancia para la actividad física.
Introducción
El receptor de tipo 4-melanocortina (MC4R) es un regulador conocido del crecimiento somático. Bloqueo genético (1) o la pérdida de la función del MC4R da como resultado un aumento del crecimiento lineal en roedores (2) y humanos (3). Curiosamente, los humanos con deficiencia de MC4R tienen un contenido de grasa corporal más bajo y, por lo tanto, una masa magra más alta en comparación con individuos deficientes en leptina con un índice de masa corporal (IMC) similar. Los ratones MC4RKO resisten la pérdida de masa magra debido al crecimiento tumoral (4) e insuficiencia renal crónica (5). Además, el bloqueo farmacológico del MC4R atenúa la pérdida de masa magra en una multitud de condiciones catabólicas (4)–(8). A pesar de esta asociación, no se ha realizado una caracterización exhaustiva de la relación entre la señalización de melanocortina y la masa magra.
También se ha informado una mayor densidad mineral en humanos (3) y animales (9) Con la deficiencia de MC4R, lo que sugiere que los aumentos en la masa ósea pueden explicar parte del fenotipo de masa magra observada en estas situaciones. Para complicar la interpretación del aumento de la masa magra en la deficiencia de melanocortina es la hipertrofia muscular compensatoria y la mineralización ósea que ocurre en paralelo con el aumento de la masa grasa. A medida que aumenta el peso corporal, la masa muscular y ósea aumenta, presumiblemente en respuesta al aumento de la carga mecánica. Por lo tanto, examinamos la composición corporal de MC4RKO y ratones obesos inducidos por la dieta (DIO) para investigar el papel de la señalización de melanocortina en la regulación de la acumulación de masa magra independiente de los aumentos en la masa de grasa.
Nuestros resultados muestran que los jóvenes ratones MC4RKO inicialmente tienen un aumento en la masa de grasa sin cambios en la masa magra en relación con los ratones WT. Sin embargo, el aumento de la masa magra se desarrolla rápidamente en relación con los ratones DIO-WT, que muestran una tasa equivalente de acumulación de masa de grasa. Este aumento de la masa magra se asocia con una disminución del rendimiento del ejercicio independiente del aumento del peso corporal y con una mayor resistencia al agarre. Además, los ratones MC4RKO tienen un aumento de inicio tardío en la masa ósea y la resistencia. Colectivamente, estos resultados demuestran que la señalización de melanocortina es un determinante fundamental de la masa corporal magra, un componente del cual incluye la masa ósea.
Resultados
La deficiencia de MC4R aumenta la acumulación de masa magra independiente de los cambios en la masa de grasa
Para examinar el curso temporal del aumento del fenotipo de masa magra en ratones Mc4rko, examinamos los jóvenes ratones WT y KO a las 7 semanas de edad. En este momento, los ratones MC4RKO aún no eran significativamente más pesados que los ratones WT (21.7 ± 0.5 g para KO frente a 21.2 ± 0.3 g para WT, P = 0.09) (Figura 1 A). Curiosamente, la masa grasa se incrementó en MC4RKO en relación con los ratones WT (2.2 ± 0.1 g para KO frente a 1.7 ± 0.1 g para WT), sin diferencias evidentes en la masa magra (18.8 ± 0.4 g para KO frente a 18.4 ± 0.2 g para WT) (Figura 1 B, C). Esto dio como resultado un mayor porcentaje de masa de grasa y una disminución del porcentaje de masa corporal magra en ratones KO en relación con los ratones WT (Figura 1 D, E).
(A) Los pesos corporales de ratones MC4RKO machos de 7 semanas de edad (n = 20) se compararon con la edad y los ratones WT coincididos con el peso (n = 10). (B) Los ratones Mc4rko han aumentado la masa grasa (do) pero masa magra normal. (D) La masa de grasa como porcentaje de peso corporal (BW) aumenta en ratones Mc4rko. (mi) La masa magra como porcentaje de peso corporal no se altera en ratones Mc4rko. Se colocó un subconjunto de ratones WT (n = 13) en HFD (DIO-WT) durante 4 semanas, de 8 a 12 semanas de edad, mientras que el resto (n = 7) se mantuvo en una dieta de bajo control de grasa (Chow-WT). Los ratones MC4RKO se mantuvieron en una dieta de bajo control de grasas durante este tiempo. (F) Los ratones MC4RKO pesaron más a las 12 semanas de edad que los ratones Dio-WT. (GRAMO) Los ratones MC4RKO tienen una masa de grasa equivalente a las 12 semanas de edad en comparación con los ratones DIO-WT. (H) Los ratones MC4RKO han aumentado la masa magra en relación con los ratones DIO-WT a las 12 semanas de edad. (I) Los ratones alimentados con un HFD durante 4 semanas obtienen una cantidad equivalente de masa grasa como ratones Mc4rko. (J) Los ratones MC4RKO obtienen más masa magra que los ratones Dio-WT. (K) % grasa corporal (L) y % de masa magra. Los datos representados como media ± SEM ** = P <0.01, *** = P <0.001 según lo calculado por la prueba t no apareada o ANOVA unidireccional con una prueba posterior a Bonferroni.
Luego exploramos si se produciría un mayor fenotipo de masa magra con el envejecimiento en los ratones Mc4rko. Para controlar los efectos del aumento del peso corporal y la masa de grasa, colocamos un subconjunto de ratones de control WT en una dieta alta en grasas (HFD) durante 4 semanas para generar DIO, mientras que el resto de los animales WT se mantuvieron en chow bajo en grasa (Chow-WT). A pesar de que los ratones DIO-WT ganaron un peso significativo durante el mes de alimentación alta en grasas en relación con los ratones Chow-WT, los ratones MC4RKO alimentados con chow obtuvieron más peso y fueron significativamente más pesados a las 12 semanas de edad (34.9 ± 0.9 g para KO frente a 31.5 ± 0.4 g para Dio-Wt vs.2.6 ± 0.4 para Chow-WT) ((Chow-WT) (((Figura 1 F). HFD produjo un aumento significativo en la masa de grasa en ratones WT durante el período de 4 semanas en relación con los ratones Chow-WT. Este aumento fue paralelo a la ganancia de masa de grasa en ratones MC4RKO alimentados con chow (6.7 ± 0.5 g para KO frente a 7.4 ± 0.5 g para DIO-WT frente a 0.5 ± 0.1 g para Chow-WT) (Figura 1 G, yo). Como resultado, al final del período de 4 semanas, los ratones WT-DIO y MC4RKO exhibieron una masa de grasa equivalente (8.9 ± 0.5 g para KO frente a 9.1 ± 0.5 g para WT frente a 2.2 ± 0.2 g para Chow-WT). Sin embargo, tanto los ratones WT-Chow como WT-DIO ganaron una masa de grasa equivalente en el transcurso de 4 semanas, sin embargo, los ratones MC4RKO ganaron casi el doble de la masa magra durante el período de un mes (6.2 ± 0.5 g para KO frente a 3.5 ± 0.4 g para WT vs. 3.0 ± 0.4 para Chow-Wt) (Figura 1 H, J). Esto dio como resultado una masa magra significativamente aumentada (25.0 ± 0.4 g para KO frente a 21.6 ± 0.3 g para WT frente a 21.8 ± 0.4 g para Chow-WT) en ratones MC4RKO en relación con los ratones DIO-WT (Figura 1 H, K, L). Al controlar el peso corporal solo considerando los 5 ratones Dio-WT más pesados y los 5 ratones MC4RKO más ligeros, las diferencias en la composición corporal se vuelven aún más pronunciadas, con ratones Mc4RKO que muestran un 25% menos de masa grasa que los ratones DIO-WT emparejados con peso.
Los ratones MC4RKO exhiben una mayor resistencia al agarre y disminuyen el rendimiento del ejercicio
Para examinar la capacidad de resistencia de los ratones Mc4rko, fueron sometidos a correr en cinta de correr. A pesar de solo diferencias leves en la composición corporal, los ratones Mc4rko mostraron una reducción dramática en el tiempo de ejecución de la cinta de correr y la distancia cubierta (Figura 2 A, B). Los ratones Mc4rko corrieron por menos de la mitad del tiempo y cubrieron solo un tercio de la distancia alcanzada por los ratones WT. No hubo una correlación significativa entre el peso corporal y el tiempo de ejecución o la distancia cubierta en ratones WT o MC4RKO (P = 0.2 para WT y P = 0.3 para MC4RKO). El rendimiento de resistencia de los ratones MC4RKO se examinó nuevamente en relación con los ratones DIO-WT a las 12 semanas de edad, y nuevamente se observó un tiempo de ejecución significativamente reducido y la distancia total recorrida en ratones MC4RKO (Figura 2 C, D). BW no fue un factor determinante en el rendimiento de ejecución de ratones MC4RKO, ya que no mostró una correlación significativa con el tiempo de ejecución o la distancia total cubierta para ratones WT o MC4RKO (P = 0.8 para WT, P = 0.8 para MC4RKO). Para determinar si un déficit funcional en el músculo esquelético podría ser responsable del fenotipo de resistencia de mal ejercicio de los ratones MC4RKO, medimos la fuerza de agarre y descubrimos que se incrementó ligeramente en ratones MC4RKO en relación con los ratones WT ((Figura 2 E). Estos datos sugieren que la señalización de melanocortina juega un papel fundamental en la determinación de la función del músculo esquelético.
Los ratones mc4rko machos de 8 semanas de edad (n = 13) y los controles WT coincidentes de edad y peso (n = 10) se sometieron a la cinta de correr a una velocidad intensificada. (A) Los ratones MC4RKO mostraron una disminución del tiempo de ejecución total de la cinta de correr. (B) Los ratones MC4RKO mostraron una disminución de la distancia de carrera de la cinta de correr. No se observó correlación entre el tiempo de ejecución o la distancia de ejecución con el peso corporal. Los ratones WT (n = 13) se colocaron en HFD (DIO-WT) durante 4 semanas hasta las 12 semanas de edad. Los ratones MC4RKO se mantuvieron en una dieta de bajo control de grasas. Después de este tiempo, se evaluó la resistencia de la cinta de correr. (do) Mc4rko mostró un tiempo de ejecución significativamente atenuado (D) y la distancia de ejecución en comparación con los ratones WT. No hubo una correlación significativa entre el tiempo de ejecución o la distancia de ejecución y el peso corporal. (mi) La fuerza de agarre también se midió antes del inicio de la alimentación alta en grasas, y se incrementó en ratones MC4RKO. Los datos representados como media ± SEM * = P <0.05, ** = P <0.01, *** = P <0.001 calculada por la prueba t no apareada.
Los ratones MC4RKO tienen una composición normal de fibra muscular y una baja frecuencia cardíaca en reposo
Para examinar las posibles causas del rendimiento de ejecución reducido en el ratón Mc4RKO, examinamos la frecuencia cardíaca en ratones MC4RKO. Encontramos una reducción significativa en la frecuencia cardíaca en ratones MC4RKO en relación con los controles WT, lo que sugiere que el rendimiento cardíaco deteriorado subyace al déficit de resistencia en estos animales (Figura 3 A). Para explorar más a fondo este hallazgo, examinamos la expresión de receptores adrenérgicos β1 y β2 en el músculo cardíaco (Figura 3 B). Mientras que la expresión del receptor adrenérgico β2 no cambió en ratones MC4RKO, el receptor β1 disminuyó en la expresión. Además, examinamos la expresión de β1 receptor adrenérgico quinasa (ADRBK1), que regula la señalización del receptor β1. No se observaron diferencias en la expresión de ADRBK1 entre los genotipos. Finalmente, también se examinó la expresión del receptor colinérgico muscarínico tipo 2 (CHRM2), lo que subyace a la supresión parasimpática de la frecuencia cardíaca. Si bien se observó una tendencia hacia la expresión disminuida en ratones MC4RKO, esto no alcanzó el nivel de significación estadística (P = 0.052). La disminución de la expresión del receptor adrenérgico β1 es de particular interés, ya que la disminución de la señalización a través de este receptor podría explicar la frecuencia cardíaca disminuida observada en ratones MC4RKO. También examinamos la composición de la fibra de los músculos gastrocnemios y sóleo, ya que las alteraciones en la abundancia relativa de las fibras glucolíticas versus oxidativas podrían explicar el fenotipo de resistencia del ejercicio deficiente en el ratón Mc4rko. El gastrocnemio de roedor está compuesto de fibras glucolíticas predominantemente tipo IIB, con fibras intermedias tipo IIA ubicadas centralmente de forma centralizada (10). Por el contrario, el ratón Soleus es …
