Resumen
Los ejercicios aeróbicos y de resistencia son los dos modos más comunes de actividad física. Pueden causar algunos cambios funcionales como la elevación del VO2máx y la masa muscular. Sin embargo, las descripciones de los cambios en la red molecular compleja inducidos por el ejercicio a menudo no son lo suficientemente completas, lo que limita la exploración de algunos indicadores nuevos. Utilizamos un método de análisis metabolómico basado en cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) para investigar las características metabólicas de 10 estudiantes universitarios varones sanos en dos momentos antes y después de una única sesión de ejercicio aeróbico y de resistencia. El análisis se realizó tanto a nivel de metabolitos como de vías metabólicas. En particular, las concentraciones de varios aminoácidos, incluidos el ácido aspártico, el ácido glutámico, la histidina y el triptófano, mostraron cambios significativos después de ambos modos de ejercicio. Estos hallazgos ofrecen una comprensión más completa de los efectos moleculares del ejercicio agudo en el cuerpo humano, contribuyendo a la evaluación de los estados fisiológicos posteriores al ejercicio y a la detección de indicadores de metabolitos relevantes. Las investigaciones futuras podrían emplear enfoques multiómicos para validar estos resultados y explorar el impacto a largo plazo del ejercicio en los perfiles metabólicos humanos, vinculando vías metabólicas específicas con resultados funcionales.
1. Introducción
El Informe sobre la situación mundial de la actividad física de la OMS publicado en 2022 muestra que más del 80% de los adolescentes y el 27% de los adultos no cumplen los niveles recomendados de actividad física (1). Aunque los beneficios del ejercicio son ampliamente reconocidos, aún quedan dudas sobre cómo hacerlo de manera más efectiva (2,3). Tanto el ejercicio aeróbico como el de resistencia se emplean comúnmente en los programas de rehabilitación. El ejercicio aeróbico generalmente se reconoce por mejorar la resistencia al ejercicio, mientras que el ejercicio de resistencia mejora el tamaño y la fuerza de los músculos. Para individuos sanos, los programas de entrenamiento deben integrar ejercicios aeróbicos y de resistencia para lograr una mejora funcional integral.4). Sin embargo, para diferentes condiciones médicas o requisitos de ejercicio específicos, la selección del modo de ejercicio debe ser más específica. Las prescripciones de ejercicio deben adaptarse para satisfacer las necesidades individuales (5,6).
En la investigación clínica, se emplean comúnmente varios indicadores funcionales para evaluar la eficacia del ejercicio, mientras que la exploración de sus mecanismos fisiológicos aún está en progreso. (7,8). Los metabolitos son moléculas pequeñas (peso molecular <1500 Da) que cambian en los procesos metabólicos. La metabolómica es la ciencia que estudia los tipos, cantidades y patrones de cambio de los metabolitos después de que un organismo sufre una perturbación (como cambios genéticos o cambios ambientales). Las pruebas exhaustivas de metabolitos permiten a las personas estudiar la interacción entre los genes y el medio ambiente (9). Según el propósito de la prueba y la diversidad de las muestras, la metabolómica se puede dividir en metabolómica dirigida, metabolómica no dirigida, etc. La metabolómica dirigida es el análisis cualitativo y cuantitativo de metabolitos o tipos específicos en muestras mediante el uso de estándares. Este método tiene mayor reproducibilidad y sensibilidad, pero necesita adquirir estándares para la validación metodológica. La metabolómica no dirigida es un enfoque integral para identificar todos los metabolitos de moléculas pequeñas dentro de un cierto rango en una muestra biológica. Ayuda a descubrir nuevos biomarcadores (10,11). Estudios recientes en investigaciones metabolómicas implican el análisis de sangre, orina, cabello y otras muestras. Entre ellos, la recolección de orina no es invasiva y carece de los mecanismos homeostáticos presentes en la sangre, lo que hace que sea más probable que magnifique los cambios metabólicos inducidos por el ejercicio.12,13).
Desarrollar una prescripción de ejercicio implica determinar el modo, la intensidad, la duración y la frecuencia del ejercicio. Estos mismos factores también influyen en los cambios en los metabolitos provocados por el ejercicio. Los estudios actuales sobre la metabolómica del ejercicio se concentran en los cambios posteriores a un modo único de ejercicio prolongado, de alta intensidad, pero menos estudios se centraron en diferentes modos de ejercicio agudo.14–16).
2. Métodos
2.1. Participantes del estudio
El protocolo de este estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad del Deporte de Shanghai, China (NO. 102772021RT139). El periodo de reclutamiento comenzó a partir del 1calle febrero de 2022–30th Junio de 2022. Diez estudiantes universitarios varones sanos se ofrecieron como voluntarios para participar en este estudio y todos firmaron un consentimiento informado por escrito. Se incluyeron participantes de entre 18 y 24 años, con un índice de masa corporal (IMC), IMC = peso (kg)/(altura (m))² que oscilaba entre 18,5 y 28, y que no informaron lesiones ni enfermedades en los últimos seis meses. Fumadores actuales (individuos que informaron haber consumido algún producto de tabaco en los últimos 30 días) (17), grandes consumidores de alcohol (≥40 gramos/día en hombres) (18), se excluirán aquellos con preferencias dietéticas, aquellos con antecedentes de enfermedades crónicas como enfermedades cardiovasculares y genética familiar, y aquellos que tomen cualquier medicamento o complemento nutricional que afecte al metabolismo de forma habitual. Las características antropométricas de los participantes se registraron en Tabla 1.
2.2. Protocolo de ejercicio
Este estudio consistió en dos sesiones de ejercicio, ejercicio aeróbico de intensidad moderada y ejercicio de resistencia de intensidad moderada. La intensidad del ejercicio se estimó como un porcentaje de la frecuencia cardíaca máxima (FCmáx) (FCmáx = 220 – edad). En primer lugar, los participantes trotaron dos vueltas en una pista de 400 metros y caminaron una vuelta, manteniendo su frecuencia cardíaca promedio entre 60 y 70% de FCmáx durante 45 minutos. Después de más de 48 h de descanso, los participantes realizaron movimientos con una barra de 5 kg, 15 repeticiones de cada movimiento × 3 series, con 60 s de descanso entre series, manteniendo su frecuencia cardíaca promedio entre 60 y 70 % de FCmáx durante 45 min (19). Todos los participantes completaron dos sesiones de ejercicio. Las dietas y los horarios de trabajo de los participantes fueron consistentes. Dentro de las 24 horas anteriores y posteriores a cada sesión de ejercicio, todos los participantes debían: 1) abstenerse de consumir alcohol y cafeína; 2) consumir cenas y desayunos estandarizados. Además, no realizaron ninguna actividad física de moderada a vigorosa durante el período experimental.
2.3. Colección de muestras
Se recogieron muestras de orina 30 minutos antes del ejercicio, 30 minutos después del ejercicio y 24 horas después de la recuperación. Las muestras se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis.
2.4. Extracción de metabolitos
Las muestras de orina almacenadas a -80°C se descongelaron a temperatura ambiente. Se tomaron 80 µl de sobrenadante de cada muestra en un vial de inyección de espectrometría de masas después del tratamiento previo. Las muestras en blanco se prepararon con agua ultrapura Milli-Q y las muestras de control de calidad (QC) se prepararon mezclando 10 μl de cada muestra. Se insertó un control de calidad en cada 10 muestras para evaluar la estabilidad del sistema durante el experimento.
2.5. Análisis LC-MS/MS
Para el análisis metabolómico no dirigido, el análisis UPLC-QTOF-MS se realizó en un espectrómetro de masas Triple TOF 5600 (SCIEX, EE. UU.) acoplado a un sistema de cromatografía líquida de ultra rendimiento Agilent 1290 Infinity II (Agilent, EE. UU.) en modo de iones positivos y negativos. La separación se realizó utilizando una columna Acquity UPLC BEH Amide (100 × 2,1 mm, 1,7 µm, Waters, EE. UU.) en modo de gradiente binario. La temperatura de la columna se ajustó a 40 °C y el volumen de inyección utilizado fue de 5 µl. Las muestras se colocaron en orden aleatorio. Se analizaron una muestra de control de calidad y un vial en blanco después de cada una de las 10 muestras de orina.
2.6. Análisis de datos
La alineación de picos, la corrección del tiempo de retención y la extracción del área de picos se realizaron utilizando el software XCMS. La identificación de metabolitos se realizó utilizando la plataforma web MetDNA (http://metdna.zhulab.cn/). Se verificó que los datos estuvieran completos y se normalizaron utilizando la plataforma web MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca/). Usar análisis estadístico multivariado para reducir la dimensionalidad de los datos y ayudar a identificar variables significativas entre diferentes muestras. En particular, las proyecciones ortogonales a análisis discriminante de estructuras latentes (OPLS-DA) son más adecuadas para la separación de dos grupos de muestras que otros métodos de análisis estadístico multivariado al incorporar corrección de señal ortogonal (OSC), que es capaz de filtrar información no relacionada con los subgrupos mientras concentra información relevante en un componente principal, maximizando así la visualización de diferencias entre grupos. Los métodos analíticos supervisados son propensos a sobreajustarse. Se utiliza una prueba de permutación con 1000 repeticiones para validar la confiabilidad del modelo. Las tendencias y la importancia de los cambios de metabolitos se presentaron en un gráfico de volcán. Los metabolitos diferenciales se examinaron mediante el cambio medio normalizado de la intensidad máxima entre los dos grupos (FC), el valor de p de una prueba t de dos colas en las intensidades máximas y la importancia variable en la proyección obtenida del análisis OPLS-DA (VIP) (FC <0,5 o FC > 2, p <0,05 y VIP > 1). Luego, los metabolitos diferenciales seleccionados se importaron a la plataforma MetaboAnalyst para el análisis de la vía metabólica, incluido el análisis de la vía y el análisis de enriquecimiento. Higo 1 muestra el flujo de trabajo para este estudio.
3. Resultados
3.1. Comparación de características metabólicas antes e inmediatamente después del ejercicio aeróbico.
3.1.1. Análisis estadístico multivariado.
Gráfico OPLS-DA (Figura 2a) muestra que las muestras estaban significativamente separadas entre los dos grupos. Después de 1000 repeticiones de la prueba de permutación (Figura 2b), el modelo encaja bien.
(a) Gráfico OPLS-DA (antes del ejercicio versus inmediatamente después del ejercicio). (b) El resultado de 1.000 repeticiones de la prueba de permutación. (c) Gráfico volcánico de metabolitos diferenciales. (d) Análisis de enriquecimiento de vías diferenciales. (e) Análisis de topología de vías diferenciales.
3.1.2. Cribado de metabolitos diferenciales.
La trama del volcán (Figura 2c) indica la distribución de los cambios en los metabolitos entre los dos grupos (antes e inmediatamente después del ejercicio aeróbico). Se analizaron un total de 29 metabolitos diferenciales, incluidos 10 regulados positivamente y 19 regulados negativamente, enumerados en Tabla 2.
3.1.3. Análisis de vías metabólicas.
Análisis de enriquecimiento (figura 2d) y análisis de vías (Figura 2e) se realizaron en los metabolitos diferenciales seleccionados. Las vías diferenciales se enumeran en Tabla 3 (p < 0,05 e Impacto > 0). El metabolismo de la alanina, el aspartato y el glutamato y el ciclo del ácido tricarboxílico son vías metabólicas diferenciales.
3.2. Comparación de características metabólicas inmediatamente y 24h después del ejercicio aeróbico.
3.2.1. Análisis estadístico multivariado.
El gráfico OPLS-DA (Figura 3a) muestra la separación significativa entre los dos grupos. Después de 1000 repeticiones de la prueba de permutación (Figura 3b), el modelo encaja bien.
(a) Parcela OPLS-DA (inmediata…
