Resumen
Antecedentes
Los efectos terapéuticos de la resistencia al ejercicio y el entrenamiento de resistencia en el alivio de la hipertrofia/atrofia muscular deben considerarse en el manejo de pacientes con enfermedades neuromusculares avanzadas. Los pacientes con enfermedades neuromusculares progresivas a menudo experimentan debilidad muscular, lo que afectan negativamente la independencia y la calidad de la vida. Mutaciones en el Valosina que contiene proteína (VCP) El gen conduce a la miopatía del cuerpo de inclusión asociada con la enfermedad de Paget de la demencia ósea y frontotemporal (IBMPFD) y más recientemente afectan el 2% de los casos diagnosticados con esclerosis lateral amiotrófica (ALS).
Métodos/Hallazgos de principios
La presente investigación se realizó para examinar los efectos del entrenamiento de ejercicios cuesta arriba y cuesta abajo sobre la histopatología muscular y la cascada de autofagia en un modelo experimental de ratón VCP que transporta la mutación R155H. Ejercicio cuesta arriba progresivo en VCPR155H/+ Los ratones revelaron una mejora significativa en la fuerza y el rendimiento muscular por la fuerza de agarre y los análisis de rotarod en comparación con los ratones sedentarios. En contraste, los ratones ejercidos para correr cuesta abajo no mostraron ninguna mejora significativa. Histológicamente, el VCP ejercido cuesta arribaR155H/+ Los ratones mostraron una mejora en la atrofia muscular y la disminución de los niveles de expresión de ubiquitina, p62/Sqstm1LC3I/II, y marcadores de autofagia TDP-43, lo que sugiere un alivio de los fenotipos de miopatía inducida por la enfermedad. También hubo una mejora en el fenotipo similar a Paget.
Introducción
La miopatía del cuerpo de inclusión asociada con la enfermedad de Paget de la demencia ósea y frontotemporal (IBMPFD) y el 2% de los casos de esclerosis lateral amiotrófica familiar (Fals) son causadas por mutaciones en el Valosina que contiene proteína (VCP) (1), (2). Los pacientes con IBMPFD muestran vacuolas bordeadas y cuerpos de inclusión ubiquitinados positivos para el ADN-43 (TDP-43) en músculo en músculo (3)–(6). La miopatía se caracteriza por la debilidad muscular y la atrofia de los músculos esqueléticos, pélvicos y de la caja de hombro. Los pacientes con ELA demuestran debilidad focal asimétrica de las extremidades o los músculos bulbar que luego se propagan a las regiones anatómicas adyacentes (7).
Con más de 27 mutaciones identificadas, la enfermedad asociada a VCP se reconoce cada vez más en todo el mundo (8) En familias de Alemania (9), (10)Francia (11)Austria (12)Italia (13), (14)el Reino Unido (15)Australia (16)Brasil (17)Corea y los Estados Unidos (18), (19). La mayoría de las mutaciones ocurren en el dominio de unión a la ubiquitina de VCP con la mutación R155H la mutación más común, lo que representa aproximadamente la mitad de los individuos afectados (2), (20), (21). VCP es miembro de la familia AAA tipo II y posee dos dominios ATPASE (22). VCP plays a critical role in a broad range of cellular activities including homotypic membrane assembly, endoplasmic reticulum-associated degradation of proteins (ERAD), the ubiquitin-proteasome system (UPS), cell cycle regulation, DNA repair, prevention of polyglutamine aggregation, autophagosome maturation in autophagy and more recently in mitophagy (for review (21)). Una mayor comprensión de estos mecanismos celulares y moleculares puede ayudar a comprender e investigar objetivos terapéuticos específicos para estos pacientes.
Los efectos de la fisiología del ejercicio se han investigado en numerosos modelos de ratones, más comúnmente en el MDX Sistema de ratón para la distrofia muscular de Duchenne (DMD). Varios informes han demostrado que el entrenamiento ejercicio mejora la función muscular y mejora el estado de la enfermedad del MDX animales (23)–(25). También se ha informado que la fisiología del ejercicio mejora la biogénesis mitocondrial muscular y la protección para ratones con miopatías mitocondriales (26), (27). Se ha demostrado que el ejercicio aeróbico crónico estimula la actividad de la proteína quinasa activada por 5 ‘-AMP (AMPK) (28)–(30). Del mismo modo, los efectos beneficiosos del entrenamiento de resistencia se han demostrado en el modelo de ratón nemalino transgénico del músculo extensor digitorum longus (EDL), revelando un nuevo mecanismo de reparación de miofibras (31). Recientemente se informó la prevención del estrés oxidativo y la hiperactividad en el sistema de ubiquitina-proteasoma en la miopatía inducida por insuficiencia cardíaca en un modelo de ratón (32). El entrenamiento de resistencia también evitó la pérdida de fuerza inducida por TNF-α en el diafragma de los ratones C57BL6 (33). En el presente estudio, evaluamos los efectos del entrenamiento con ejercicios y exploramos su potencial eficacia terapéutica en nuestro modelo de enfermedad VCP. Observamos que el entrenamiento de resistencia a la cinta de correr mejoró la fuerza y la masa muscular, representamos un número disminuido de cuerpos de inclusión y células apoptóticas, disminuyó los niveles de los marcadores en cascada de autofagia y en general destaca el valor traslacional de la intervención clínica para pacientes con enfermedad por VCP.
Materiales y métodos
Declaración ética
Todos los experimentos se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California, Irvine (UCI) (Protocolo IACUC #2007-2716-2), y de acuerdo con las directrices establecidas por los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Los animales se alojaron en el vivario y se mantuvieron a temperatura constante (22 ° C) y humedad con un ciclo de luz de luz de 12∶12 horas controlado. Se proporcionaron ratones a chow de roedor estándar (Harlan Teklad Rodent Diet, Madison, WI) y agua ad libitum. Todos los ratones se limitaron a sus jaulas individuales durante todo el estudio.
Protocolo de ejercicio de cinta de correr
Generación, genotipado y caracterización del VCP heterocigotoR155H/+ y los animales de WT han sido descritos anteriormente (34), (35). Los estudios de medición de línea de base se realizaron en el VCPR155H/+ y ratones WT antes de preparar los ratones para los estudios de ejercicios. Los ratones de 18 meses se dividieron en cuatro grupos de 8-10 ratones cada uno para ejercicios cuesta arriba y cuesta abajo: (a) VCPR155H/+ ratones sin ejercicio, (b) VCPR155H/+ Ratones con ejercicio, (c) WT Bailtermates sin ejercicio y (d) compañeros de basura con ejercicio. Los ratones en el grupo de ejercicios se ejecutaron en la cinta de correr 3/6 (Columbus Instruments, Columbus, OH), que consta de seis carriles para correr y un sistema de estímulo eléctrico compuesto de cuadrículas de choque. El siguiente protocolo de carga de trabajo se implementó durante 6 semanas con el ejercicio realizado 3 días por semana: Semana 0: Los ratones se prepararon a una velocidad de 5 m/min con una inclinación o declinación de 0 grados durante 10 minutos; Semana 1: Los ratones corrieron a una velocidad de 10 m/min con una inclinación o declinación de 5 grados durante 20 min; Semana 2: Los ratones corrieron a una velocidad de 12 m/min con una inclinación o declinación de 10 grados durante 30 min; Semanas 3–6: Los ratones corrieron a una velocidad de 12 m/min con una inclinación o declinación de 15 grados durante 30 min. Los ratones de control se colocaron en una jaula diferente durante 10-30 minutos como un estímulo simulado de acuerdo con el horario mencionado anteriormente.
Estudios de medición
Pesos y puntos de supervivencia del WT y VCPR155H/+ El ejercicio (ex) y los animales sedentarios (SED) se midieron semanalmente para seguir el desarrollo de la masa corporal. Se colocaron ratones en el aparato de rotarod antes y después del protocolo de ejercicio, acelerando de 4 a 40 rpm en 5 minutos. Los ratones pasaron por tres ensayos con intervalos entre juicios de 45 minutos a 60 minutos en cada uno de los dos días consecutivos. El propósito del primer día fue que los ratones se aclimaten al aparato, y luego, durante el segundo día, se registró el rendimiento de Rotarod (en segundos). La fuerza muscular de las extremidades anteriores de los ratones se midió utilizando un aparato del medidor de fuerza de agarre (TSE Systems GmbH, Hamburgo, Alemania). Brevemente, se sostuvieron ratones desde la punta de la cola sobre la cuadrícula y se bajaron suavemente hacia abajo hasta que las patas delanteras agarraron la cuadrícula. El animal fue llevado a una posición casi horizontal y se retiró suavemente, pero constantemente hasta que se liberó su agarre. Las extremidades posteriores se mantuvieron libres de contacto con la cuadrícula. Se registró la fuerza máxima lograda por el animal y cada animal se sometió a 5 pruebas con rupturas de 5 minutos entre cada medición.
Análisis histoquímicos
Después del régimen de ejercicio de la cinta de correr, el músculo cuádriceps de EX y SED VCPR155H/+ y los ratones WT fueron cosechados e incrustados en medios de montaje de criocresión (ciencias de la microscopía electrónica, Hatfield, PA) y se colocaron en baño de isopentano previamente enfriado en nitrógeno líquido. Las muestras se almacenaron a -80 ° C antes de seccionar a 5–10 µm de espesor. Para los análisis inmunohistoquímicos, las secciones se tiñeron con TDP-43, ubiquitina, VCP, LC3-I/II, P62/Sqstm1y anticuerpos específicos de Coxiv (Abcam, Cambridge, MA). Posteriormente, las secciones se lavaron con PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con fluoresceína (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 1 hora a temperatura ambiente y se montaron con medios de montaje que contienen DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) y analizado por la microscopía de fluorescencia. Además, la tinción de hematoxilina y eosina (H&E), SDH y NADH se realizó utilizando métodos de rutina y se cuantificó por microscopía óptica (Carl Zeiss, Thornwood, NY) como se describió anteriormente (35).
Cuantificación de la expresión de proteínas
Muestras musculares cuádriceps del ejercicio y VCP sedentarioR155H/+ y los ratones WT fueron cosechados y extraídos utilizando el kit de extracción nuclear y citoplasmática NE por (Thermo Scientific, Rockford, IL). Las concentraciones de proteínas se determinaron usando el nanodrop de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se separaron cantidades iguales de proteínas en geles de NuPage BIS-Tris 4–12% (Invitrogen Life Technologies Inc., Carlsbad, CA), y se ejecutaron en una célula mini novexa durante 35 minutos a 200 V. Los niveles de expresión de proteínas se analizaron por transferencia Western usando VCP, TDP-43, Coxiv, P62/Sqstm1LC3-I/II, y anticuerpos específicos de ubiquitina. Las membranas se lavaron en TBST (0.5%) y se sondearon con anticuerpos secundarios anti-ratón o anti-conejo durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavaron las membranas y las bandas se detectaron utilizando el kit de quimioluminiscencia Immun-Star ™ Westernc ™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) como se describió anteriormente (35), (36). La igualdad de carga de proteínas se confirmó mediante tinción con el anticuerpo de tubulina alfa (tinción de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
Análisis de tunel
La apoptosis en muestras de tejido muscular cuádriceps de ratón se analizó mediante el sistema de Tunel fluorométrico de Deadend (Promega, Madison, WI). Para el análisis de Tunel, las criosecciones musculares de EX o SED VCPR155H/+ Los ratones y los compañeros de camada WT se tiñeron como se describió anteriormente (34). Brevemente, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 15 minutos, se lavaron en PBS durante 5 minutos y se permeabilizaron con una solución de proteinasa K de 20 µg/ml durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se lavaron las células en PBS durante 5 minutos y se añadieron 100 µl de tampón de equilibrio durante 10 minutos. Las células se marcaron con 50 µl de mezcla de reacción TDT y se incubaron durante 60 minutos a 37 ° C en una cámara humidificada. La reacción de parada se agregó durante 15 minutos después de lo cual las células se lavaron, contrataron y se prepararon para el análisis. Se calculó el porcentaje de células Tunel+.
Estadística
Todos los datos se expresan como valor medio ± error estándar de la media. Diferencias en las variables continuas entre WT ejercicio y sedentario y heterocigoto VCPR155H/+ utilizando un análisis de varianza unidireccional con pares T-Las pruebas corregidas para comparaciones múltiples se compararon. Para los datos categóricos, utilizamos una prueba de chi-cuadrado con pruebas por pares utilizando la prueba exacta de Fisher. Un valor de probabilidad de ≤0.05 se consideró estadísticamente significativo.
Resultados
Efectos del ejercicio de la cinta de correr sobre la fuerza muscular y el rendimiento de la carrera
Los pacientes con enfermedad asociada a VCP tienen un inicio lento progresivo de miopatía que involucra los músculos y caderas de la cintura del hombro. Caracterizamos nuestro VCP transgénico de 19 mesesR155H/+ animales y características y características encontradas típicas de la enfermedad de IBMPFD humana (35). Las mediciones de peso del VCPR155H/+ y wt antes y después …
