Resumen
El mellitus prediabético (PDM) se caracteriza por una inflamación crónica de bajo grado, impulsada principalmente por la hiperactivación del inflamasoma NLRP3 y una deficiencia concurrente de la mioquina irisina. MCC950 es un inhibidor altamente específico del inflamasoma NLRP3 y también se ha demostrado que el ejercicio aeróbico suprime eficazmente su activación. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes siguen sin estar claros. El objetivo de este proyecto fue explorar si la vía de señalización irisina/NLRP3 estaba regulada por el ejercicio aeróbico en ratones con PDM. Cuarenta ratones se dividieron en: el grupo de dieta común (grupo DC, N = 10) y el grupo de dieta alta en grasas (grupo HFD, N = 30). El grupo HFD recibió una dieta rica en grasas combinada con una única inyección de estreptozotocina (STZ) en dosis baja para inducir un estado prediabético. Los ratones modelados con éxito se identificaron como ratones PDM y se asignaron aleatoriamente a tres subgrupos: el grupo de control PDM (grupo PDM-DC, N = 8), el grupo PDM más ejercicio (grupo PDM-EX, N = 8) y el grupo PDM más MCC950 (grupo PDM-MC, N = 8). El grupo PDM-EX realizó ejercicio en cinta rodante durante 4 semanas (5 días/semana, 12 m/min, 60 min/d). El grupo PDM-MC recibió inyecciones de inhibidor de NLRP3 (MCC950, 10 mg/kg, 5 días/semana) durante 4 semanas. Estos resultados encontraron que el ejercicio aeróbico y MCC950 mejoraron el metabolismo de los glicolípidos, redujeron los niveles de insulina y facilitaron eficazmente la remodelación del músculo esquelético en ratones PDM. En comparación con el grupo DC, los ratones PDM exhibieron una regulación negativa significativa FNDC5/expresión de irisina y expresión regulada positivamente de NLRP3 e IL-18 (PAG< 0,05 o PAG < 0,01). En particular, el ejercicio aeróbico aumentó significativamente FNDC5 /expresión irisina (PAG < 0,05) y niveles reducidos de NLRP3 e IL-18 (PAG< 0,01). Los experimentos celulares revelaron que la expresión de ARNm y proteínas de NLRP3, IL-1β e IL-18 en la condición de alto nivel de glucosa (HG) fue mayor en comparación con la condición de bajo nivel de glucosa (CON).PAG< 0,01). El tratamiento con irisina atenuó significativamente estos aumentos (PAG< 0,05 o PAG< 0,01). Estos hallazgos demuestran que el ejercicio aeróbico alivia la inflamación y mejora el metabolismo de los glicolípidos en ratones PDM al modular la vía de señalización de irisina/NLRP3. Además, la irisina suprime eficazmente la regulación positiva inducida por la glucosa de NLRP3, IL-1β e IL-18, lo que sugiere su posible papel terapéutico en el tratamiento de la inflamación prediabética.
Introducción
La prediabetes mellitus (PDM), o alteración de la regulación de la glucosa, es una etapa crítica entre la homeostasis normal de la glucosa y la diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Durante este período compensatorio, los niveles de glucosa en ayunas o posprandial están sólo ligeramente elevados, sin embargo, el riesgo de desarrollar diabetes manifiesta dentro de 5 a 10 años es aproximadamente del 70%.1). La principal característica de la prediabetes es un cierto grado de metabolismo anormal de la glucosa y los lípidos. La reducción de la utilización de glucosa y el aumento de la gluconeogénesis son factores importantes que contribuyen al trastorno del metabolismo de la glucosa (2). El aumento anormal del colesterol total (CT) y los triglicéridos (TG) y la disminución anormal de las lipoproteínas de alta densidad conducen a un trastorno del metabolismo de los lípidos (3). Dirigirse a estos defectos tempranos ofrece la estrategia más rentable para detener la progresión de la diabetes.
La evidencia acumulada posiciona a la inflamación crónica de bajo grado como un factor central de la resistencia a la insulina (RI) asociada a PDM (4). Ya en 1995, Unger et al. descubrió que el vínculo central en la aparición de la diabetes es la respuesta inflamatoria crónica de los tejidos diana (5). En la diabetes mellitus, el cuerpo suele presentar un estado inflamatorio crónico de bajo grado. Se manifiesta principalmente como la activación del inflamasoma NLRP3, IL-1β y otros factores inflamatorios (6), entre los cuales el inflamasoma NLRP3 es el receptor más directo de señales inflamatorias y un factor desencadenante clave de la inflamación (7,8). MCC950 es altamente específico para bloquear el inflamasoma NLRP3, que puede inhibir NLRP3 y aliviar el estado inflamatorio (9). Sin embargo, el efecto de MCC950 sobre los factores inflamasómicos y la homeostasis de la glucosa en la PDM aún no está claro. Además, cada vez hay más estudios que proporcionan evidencia exacta de que el ejercicio aeróbico ofrece un enfoque no farmacológico para aliviar la diabetes y la inflamación relacionada (10). Los estudios han demostrado que el ejercicio aeróbico puede reducir la inflamación, mejorar la sensibilidad a la insulina y participar en la regulación de la homeostasis de la glucosa al inhibir el inflamasoma NLRP3 y promover la señalización PI3K/Akt.6). Además, el ejercicio aeróbico ofrece un enfoque no farmacológico para controlar la inflamación mediante la inhibición del inflamasoma NLRP3, que puede conducir a aliviar la IR y el daño hepático en pacientes con PDM de edad avanzada (11). Nuestra investigación anterior reveló además que el ejercicio aeróbico era una forma eficaz de aliviar la glucosa en sangre y la RI en la prediabetes, particularmente a través de su impacto en el inflamasoma NLRP3 (12). En resumen, el ejercicio aeróbico puede aliviar la diabetes y la PDM al inhibir el inflamasoma NLRP3. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes aún son difíciles de alcanzar.
Se ha informado que la irisina tiene un potencial importante para reducir la gluconeogénesis, y una mayor utilización de la glucosa podría hacer que tenga un papel importante en el control de la diabetes.13). La investigación ha indicado que la irisina puede aliviar sus enfermedades relacionadas al reducir el inflamasoma NLRP3 (14,15). El entrenamiento físico regular es una práctica beneficiosa para aumentar la secreción de irisina. En roedores, se ha demostrado que el ejercicio aeróbico induce un aumento de la secreción de irisina en el tejido muscular.16,17) y suero, y regulan positivamente el precursor de irisina FNDC5expresión (18). En personas sanas, FNDC5La expresión de ARNm en el músculo esquelético y la irisina sérica también están elevadas después del entrenamiento aeróbico.19). Sin embargo, el papel de la señalización de la irisina en la mejora del desequilibrio de glucosa en sangre inducido por la prediabetes en ratones PDM y su mecanismo molecular aún no están claros.
El músculo esquelético juega un papel importante en el equilibrio sistémico de la glucosa en sangre (20). Los estudios han demostrado que la regulación de la homeostasis sistémica de la glucosa depende principalmente de la sensibilidad del músculo esquelético a la insulina y su capacidad para almacenar glucógeno.21). Por lo tanto, nos centramos en la señalización de irisina/NLRP3 en el músculo esquelético de ratones con PDM en respuesta a la intervención de ejercicio aeróbico. En este estudio, establecimos el modelo de ratones PDM y aplicamos una intervención de ejercicio aeróbico para investigar: i) la relación entre la señalización de irisina/NLRP3, la inflamación del músculo esquelético y la homeostasis de la glucosa, y ii) los cambios en el metabolismo de la glucosa y los lípidos en ratones PDM después de la intervención de ejercicio aeróbico y su mecanismo potencial. Se espera que nuestros hallazgos proporcionen información mecanicista sobre la prescripción de ejercicio e identifiquen la irisina-NLRP3 como un posible objetivo terapéutico para el tratamiento de la PDM.
Diseño y métodos de investigación.
protocolo general
El experimento constaba de dos partes: un estudio en animales y un estudio en células. El estudio en animales tuvo como objetivo investigar si el ejercicio aeróbico alivia la desregulación de la glucosa en sangre inducida por la prediabetes a través de la supresión mediada por la irisina del inflamasoma NLRP3 en el músculo esquelético. El experimento celular fue diseñado principalmente para explorar la relación entre la irisina y NLRP3, y los detalles se muestran en Figura 1A y 1B.
(A. Diagrama de flujo de investigación del experimento con animales. B. Diagrama de flujo de investigación del experimento con células. C. Protocolo de implementación detallado del experimento con animales. Abreviatura: DC (grupo de dieta común); STZ (estreptozotocina); PDM (prediabetes mellitus); FBG (glucosa en sangre en ayunas); PDM-DC (grupo de control de PDM); PDM-MC (grupo de PDM más MCC950); PDM-EX (grupo de PDM más ejercicio); FINS (insulina en ayunas); CON (condición de glucosa baja); HG (condición de glucosa alta) (grupo de dieta alta en grasas); ITT (prueba de tolerancia a la insulina));
Animales de experimentación
Se compraron cuarenta ratones C57BL/6J del Centro de Investigación Animal de Wuhan. Los ratones se dividieron en el grupo de dieta común (grupo DC, N = 10) y el grupo de dieta alta en grasas (grupo HFD, N = 30) después de una semana de adaptación. Se administró una dieta de mantenimiento al grupo DC (11001, 2,37 kcal/g, Boaigang, Beijing, China). La dieta alta en grasas se utilizó en el grupo HFD (12492 M, 5,24 kcal/g, Boaigang, Beijing, China). El número de aprobación del estudio es No. YZLL2022-009. Toda la cirugía se realizó bajo anestesia inyectable de Avertin y se hicieron todos los esfuerzos posibles para minimizar el sufrimiento.
El modelo de ratones PDM se estableció con éxito
En este estudio, después de 4 semanas de alimentación rica en grasas, a los ratones HFD se les administró una inyección intraperitoneal única de una dosis baja de estreptozotocina (STZ) de 110 mg/kg. Después de que la glucosa en sangre se estabilizó, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 8 horas y se recogieron muestras de sangre de la punta de la cola. La glucemia en ayunas (FBG) se midió mediante un glucómetro. Si la FBG de los ratones fuera 9,0 < FBG < 13,8 mmol/L (22), se consideró que los ratones PDM habían sido inducidos con éxito. La FBG fue obviamente mayor en el grupo PDM (12,68 ± 1,27 mmol/L) que en el grupo DC (4,98 ± 0,68 mmol/L) (PAG< 0,01) después de una inyección rica en grasas combinada con STZ. Un total de 24 ratones cumplieron los criterios de modelado de PDM. Luego, los ratones PDM se dividieron en: el grupo de control PDM (grupo PDM-DC, N = 8), el grupo PDM más ejercicio (grupo PDM-EX, N = 8) y el grupo PDM más MCC950 (grupo PDM-MC, N = 8), a los tres grupos se les administró la inyección de un volumen igual de solución salina fisiológica. (Como se muestra en Figura 1C).
ejercicio en cinta rodante
El experimento adoptó la intervención de ejercicio en cinta rodante de intensidad moderada a baja durante 4 semanas. La intensidad de la intervención de ejercicio fue cuidadosamente calibrada y refinada según el protocolo establecido por Bobinski et al. (23). El grupo PDM-EX fue tratado con ejercicio adaptativo en cinta rodante y la intensidad del ejercicio fue de 10 m/min en los primeros 3 días y de 12 m/min en los segundos 2 días, 30 min al día durante 5 días. El tiempo de intervención formal del grupo PDM-EX fue de 4 semanas y la intensidad del ejercicio fue de 12 m/min, 60 min/dy 5 d/semana. El horario de entrenamiento es de 5:00 a 6:00 p. m. Los ratones PDM mantuvieron una dieta rica en grasas durante el período de intervención.
Intervención inhibidora
Se seleccionó MCC950 como inhibidor de NLRP3. A los ratones del grupo PDM-MC se les inyectó por vía intraperitoneal MCC950 (Selleck, S7809) a una dosis experimental de 10 mg/kg de peso corporal según Wang et al. (2022) (24), y un volumen de inyección de 10 ml/kg, 5 veces/semana. El período de intervención fue de 4 semanas.
Prueba de tolerancia a la glucosa (GTT) y prueba de tolerancia a la insulina (ITT)
Los ratones fueron alimentados con una solución de glucosa al 20% (1 g/kg) después de un ayuno de 12 h, después de que se detectara la glucosa en sangre a los 0, 30, 60, 90 y 120 min. La ITT se determinó 3 días después de detectar la GTT. Después de ayunar durante 6 h, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal una solución de insulina (1 UI/kg), y se midió la glucosa en sangre a los 0, 30, 60, 90 y 120 min.
Dilución de irisina
Disolver 10 g de polvo de irisina (MedChemExpress, HY-P70664) en 100 l de H₂O dd estéril para preparar una solución madre de 100 g/ml. Tome 2 µl de la solución madre, agregue 48 µl de H₂O dd estéril, mezcle bien y diluya hasta obtener una solución de trabajo de 4 ng/µl. Tome 5 l de la solución de trabajo, agréguelo a 2 ml de medio de cultivo celular, mezcle bien y obtenga una concentración final de irisina de 10 ng/ml.
Cultivo y agrupación de mioblastos C2C12.
Para probar la señalización de irisina en condiciones bajas vs.En condiciones de alto contenido de glucosa, los mioblastos C2C12 fueron digeridos por enzimas pancreáticas y se inocularon en placas de seis pocillos usando medio DMEM (bajo en glucosa, que contiene 10% de suero bovino fetal) y se cultivaron a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 horas. Cuando la densidad celular aumentó a aproximadamente el 80%, el medio de cultivo original se eliminó y se dividió en cuatro grupos, el medio de cultivo fue: ① DMEM (bajo en glucosa, que contiene 10% de suero bovino fetal), denominado CON…
